組換えハンタウイルス核蛋白を用いたRNPトランスフェクション系の確立

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これまでに、私は蚕のバキュロウイルス系を用いて、ハンタウイルスの核蛋白を大量に発現するシステムを開発してきた.今回の研究では、この組換え蛋白を用いて、RNPトランスフェクション系を確立する事を目的とした.ハンタウイルス核蛋白を蚕のヘモリンフ中に発現させた場合、不溶性となる.この不溶性蛋白は、尿素及びグアニジン塩酸塩で可溶化され、特に尿素存在下で陰イオン交換クロマトグラフィーを行った場合、可溶性の蛋白として精製が可能である.しかしながら、この蛋白は消化を受け、フラグメント化されている場合が多い.これをさらに精製し、全長の核蛋白のみを精製するため、核蛋白に対するモノクローナル抗体を使ったAffinity精製を試みた.結果は収率は著しく低いものの、全長を含む核蛋白も精製が可能であった.しかしながら、これらの核蛋白に対するモノクローナル抗体を用いて精製した場合、それぞれの抗体の認識部位によって精製されるフラグメントが異なる.このため、これらの抗体の一次構造上の認識部位を決定しておく必要が生じた.また、Derai et alは大腸菌による発現組換え蛋白がRNA結合能を保持していたことを報告している.このため、大腸菌の発現系を利用し、抗原部位の決定を試みた.結論は、比較的効率よく全長の組換え蛋白を精製できるモノクローナル抗体は、立体構造認識の一部の単クローン抗体と、N末端を認識する抗体であった.中央部を認識する抗体は、多くのフラグメントを結合したので、今回の目的には適さないことがわかった.ハンタウイルス持続感染Vero細胞は3世代までのPassageには支障がなかった.このウイルスは持続感染しやすく、細胞の増殖には影響がないようであり、持続感染株の樹立は容易であると考えられる.今年度の計画は、最終目標まで到達することはできなかったが、その準備は十分にできたと考えられる.