肝臓ギャップ結合の単位粒子には異なる構成蛋白コネキシンが混在しているのか

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ギャップ結合の基本単位粒子であるhemichannel(コネクソン)は構成蛋白コネキシン(Cx)の6量体である。本研究ではこの単位粒子レベルでの異種コネキシン蛋白の混在様態につき、Cx32とCx26が共存する肝ギャップ結合膜をモデル系とし検討を加えた。1.形態分析:界面活性剤(dodecyl maltoside)処理した肝ギャップ結合膜フラクションにつき急速凍結ディープエッチレプリカ法およびネガティブ染色法にて電顕観察を行なったところ、直径9nm前後のほぼ均一な粒子が観察され、それらの中央には親水性通路と推定される構造が認められたことから、目的のhemichannel粒子であることが確認された。Cx32とCx26の構成比の異なるラットおよびモルモット肝由来の単位粒子間には特に形態学的な差異は認められなかった。2.生化学的分析:飽和濃度以下のクロスリンカーで処理した試料をSDS-PAGEで展開しウェスタン分析を行なったところ、抗Cx32抗体と抗Cx26抗体は明らかに異なるバンドをそれぞれ標識したことから、単位粒子は単一のコネキシン蛋白で構成されることが示唆された。また阪大蛋白研との共同研究で、高速液体クロマトグラフィーを用いた単位粒子分画の精製溶出条件が明らかになった。この条件下での溶出分画のSDS-PAGE分析からCx32とCx26は常に同期して溶出され、少なくともCx32もしくはCx26のみから構成される単位粒子間には大きなサイズの差がないことが示唆された。今後、分子量分析のための各種パラメーターを測定し、分析超遠心法などによる精密な分子量測定によって単一hemichannel中の蛋白構成を明らかにしたい。