新しいヒト好中球走化性蛋白質LECT2b遺伝子産物の活性の解析と大量産生系の確立

人中性粒细胞趋化蛋白LECT2b新基因产物活性分析及量产体系建立

• 批准号: 06770177
• 负责人: 山越 智
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: 国立予防衛生研究所
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770177/
• 关键词: ヒト好中球活性化蛋白質; LECT2

本研究は、新規LECT2b遺伝子の産物の分子的性状、及び生物学的活性の解明のために、recombinant LECT2bを大量に合成できる系を確立、rLECT2bタンパク質の活性の検討、モノ-クロナル抗体の作成を目的とした。はじめにrecombinant LECT2bの大量産生系を構築するために大腸菌を用いた。pMAL-cベクターを用いmaltose binding proteinとの融合蛋白質を合成することを計画した。本来このベクターには、連結部位にXa proteaseの認識部位が導入して有るが、LECT2b領域でXa proteaseによる非特異的分解が見られた。そこでこの連結部位にTEV proteaseの認識配列を導入したところ特異的切断できることがわかった。しかしながらproteaseによる特異的切断後maltose binding proteinとLECT2bの非共有的な結合がみられることが判明し大腸菌によるLECT2bの精製はできなかった。この融合タンパク質を用いモノクローナル抗体の作製を試みたが得られたハイブリドーマの全てがmaltose binding proteinを認識するものであった。さらに動物細胞での発現を試みた。pcDL-SRα296ベクターにLE CT2bのcDNAを導入後CHO細胞、L-929細胞にトランスフェクションし、スクリーニングした結果、2種類の高発現クローンC1D8-1(CHO cell derived),L2E4-1(L-929 cell derived)を得ることができた。それぞれ大量培養し精製分離後、N末端のアミノ酸配列を決定した結果LECT2bの期待される配列を持ち4 literの培養より約20mgのrLECT2bが得られることが判明した。これらのことによりrLECT2bはLECT2aと同様分泌性タンパク質であり、LECT2aに相同するN末端を持つことが分かった。このrLECT2bを用いヒト好中球に対する作用を調べた。その結果、それ単独では好中球機能を活性化する機能を有していなかったが、10^<-6> -10^<-8>の濃度でfMLPによる好中球の活性化を増強する事が判明した。

This study aims to elucidate the molecular properties and biological activities of the products of the new LECT2b gene, establish the system for the synthesis of recombinant LECT2b in large quantities, investigate the molecular properties and biological activities of rLECT2b gene products, and prepare anti-LECT2b antibodies. A large number of recombinant LECT2b were produced in the construction of E. coli. pMAL-c fusion protein synthesis with malose binding protein Originally, Xa protease recognition site was introduced into LECT 2b domain, and non-specific decomposition of Xa protease was observed. TEV protein recognition and alignment in the link site The specific cleavage of malose binding protein and LECT2b is not common. The fusion protein is used to prepare the antibody. Today, animal cells are discovered. After pcDL-SR α 296 cDNA was introduced into CHO cells and L-929 cells, two kinds of highly expressed cDNA C1D8 - 1 (CHO cell derived) and L2E4 - 1 (L-929 cell derived) were obtained. After mass culture, purification and isolation, the N-terminal amino acid alignment was determined. The expected alignment of LECT2b was determined by 4 liter culture. About 20 mg of rLECT2b was obtained. LECT2b has the same secretory properties as LECT2a, and LECT2a has the same N terminal. The rLECT 2b is used to adjust the function of the ball. As a result, it has been found that the activity of FMLP is enhanced at concentrations of 10 ^-10 ^.<-6><-8>