ウェルシュ菌における病原因子のグローバル制御機構の解析

申請時に提出した計画書の通りに実験を行ない、以下の結果を得たので報告する。1.ウェルシュ菌染色体ライブラリーの作製シャトルベクターpJIR418のHindIII切断部位へ、ウェルシュ菌strain13の染色体をHindIIIに部分分解した3-7kbの断片を挿入し、大腸菌へ形質転換して染色体ライブラリーを作製した。得られた大腸菌コロニーを集菌し、プラスミドDNAを大量調整して以下の実験に用いた。ライブラリーより96穴マイクロタイタ-プレートを用いてプラスミドを計1,200個調製し、フィルターメンブラン上へそれぞれをブロットして変性後、スクリーニングに用いた。2.ウェルシュ菌virR遺伝子により転写レベルで調節される遺伝子群の同定ウェルシュ菌strain 13とそのvirR遺伝子変異株TS133株より全RNAを調製し、それぞれをrandom primer、[α-^<32>P]dCTR、AMV reverse transcriptaseを用いてラベルした。前述のライブラリーをブロットしたフィルターに対してこれらのプローブをハイブリダイゼーションし、strain13とTS133のプローブでハイブリダイズした放射活性を比較し、明らかに活性の異なるクローンを選択した。計15個のクローンが選択され、そのうちstrain13の方が強いものが9個、TS133の方が強いものが6個であった。このことは、得られたクローンのうち9個がvirRによって正に調節され、残りの6個は負に調節される遺伝子を含んでいる可能性を示している。これらのクローンのプラスミドDNAを調べたところ、全て異なる長さのDNA断片を含んでおり、virRによって調節される複数の遺伝子群がクローニングされたと思われる。今後、これらのクローンについてさらなる解析を行っていきたい。

申請時に提出した計画書の通りに実験を行ない、以下の結果を得たので報告する。1.ウェルシュ菌染色体ライブラリーの作製シャトルベクターpJIR418のHindIII切断部位へ、ウェルシュ菌strain13の染色体をHindIIIに部分分解した3-7kbの断片を挿入し、大腸菌へ形質転換して染色体ライブラリーを作製した。得られた大腸菌コロニーを集菌し、プラスミドDNAを大量調整して以下の実験に用いた。ライブラリーより96穴マイクロタイタ-プレートを用いてプラスミドを計1,200個調製し、フィルターメンブラン上へそれぞれをブロットして変性後、スクリーニングに用いた。2.ウェルシュ菌virR遺伝子により転写レベルで調節される遺伝子群の同定ウェルシュ菌strain 13とそのvirR遺伝子変異株TS133株より全RNAを調製し、それぞれをrandom primer、[α-^<32>P]dCTR、AMV reverse transcriptaseを用いてラベルした。前述のライブラリーをブロットしたフィルターに対してこれらのプローブをハイブリダイゼーションし、strain13とTS133のプローブでハイブリダイズした放射活性を比較し、明らかに活性の異なるクローンを選択した。計15個のクローンが選択され、そのうちstrain13の方が強いものが9個、TS133の方が強いものが6個であった。このことは、得られたクローンのうち9個がvirRによって正に調節され、残りの6個は負に調節される遺伝子を含んでいる可能性を示している。これらのクローンのプラスミドDNAを調べたところ、全て異なる長さのDNA断片を含んでおり、virRによって調節される複数の遺伝子群がクローニングされたと思われる。今後、これらのクローンについてさらなる解析を行っていきたい。