病原細菌の新規染色体複製システムの解明

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24年度はDNAマイクロアレイを用いた複製中の染色体DNAの定量を行なった。ウェルシュ菌strain 13をGAM培地中にて37°Cで培養を行い、増殖の活発な対数増殖期の染色体DNAを調製し、さらにコントロールとして静止期のDNAを調製した。両DNAを鋳型としCy5 、Cy3でラベルしたcDNAを合成し、ウェルシュ菌DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせ、本菌の全遺伝子領域ごとの両増殖時期のDNA量を定量し静止期を分母とした対数増殖期のDNA量を計算した。その結果、対数増殖期の複製開始点 (ori) のDNA量は複製終止点 (ter) よりも2倍程度多く、基本的なori-ter型の複製が進んでいることが示されたが、oriからterに至る途中の領域にもDNA量が多い部分、つまり部分的にDNA複製が起きている可能性のある領域が複数確認された。これらの染色体複製部位を詳細に解析するため、対数増殖期~静止期における時間ごとの変化を解析した。これらの複製部位におけるDNA量は初期では複数の複製開始ピークが見られたが、時間とともにその数と大きさが減少し通常の複製パターンを示していくことが判明した。培養温度を30°C に変化させ増殖速度を抑制すると、通常のori-ter型の複製パターンしか見られなかったことから、複数の複製開始ピークは増殖速度が速い時に現れる現象であることが推察された。さらに独立した実験として、ウェルシュ菌DNA断片をクロラムフェニコール耐性遺伝子に結合させて遺伝子ライブラリーを作成し、ウェルシュ菌に形質転換したところ、本来はDNAを複製できずに耐性菌の生育が見られないはずのところ、多数の菌が生育した。このことはこれらの菌内にあるDNAにDNA複製開始部位が含まれることを示唆しており、ウェルシュ菌DNAには自己複製部位が多数存在することが強く考えられた。