ヒト細胞のDNA代謝に関与するヘリカーゼの探索と構造解析

参与人体细胞DNA代谢的解旋酶的搜索和结构分析

基本信息

批准号：
07772205
负责人：
浴俊彦
金额：
$ 0.7万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772205/
关键词：
ヘリカーゼファミリー DNA代謝 RNA代謝ホモロジーサーチ酵母 cDNA ホモログ

项目摘要

(1)系統的なヒトヘリカーゼファミリー遺伝子を単離するために、ヘリカーゼファミリーに共通したモチーフ配列(DEAD等 motif I-VI)に対するPCR primerをデザインして、HeLa細胞より作製されたcDNAライブラリーからPCRによって候補遺伝子断片を増幅・回収することを試みた。単離されたcDNA断片をクローンし、一部につき塩基配列解析を行った。しかし、ライブラリー中のcDNA種の偏りを反映し、elongation factorなどabundantなcDNAクローン断片が数多く得られ、稀少なcDNA種を見出すことは困難であった。(2)そこでヘリカーゼファミリーの単離について、(1)とは別のアプローチを取ることに決めた。即ち、現在、その全塩基配列が決定されつつある酵母遺伝子からヘリカーゼファミリーに保存されたモチーフを持った遺伝子を同定し、これらの遺伝子の遺伝子破壊、蛋白質発現によるヘリカーゼ活性の検討、および相同性検索によるヒトホモログの同定を通じて、新たなヘリカーゼファミリー遺伝子を単離することを試みている。既に酵母で変異株などとして同定されたものを除く新規遺伝子8個を選び、遺伝子破壊を行った結果、少なくとも5個の増殖に必須なヘリカーゼファミリー遺伝子を見出している。現在、その生理的機能・酵素活性などについて検討している。(3)生化学的に同定されたヘリカーゼについてそれらの一次構造(モチーフ)情報を得るため、東大・薬学部(榎本助教授)と共同で、マウスDNAヘリカーゼBについてその一次構造解析を行った。しかし、ヒトDNAヘリカーゼBについては複数のcDNAライブラリーやRT-PCRなどによるスクリーニングでは単離することができなかった。

（1）为了隔离系统的人旋转酶家族基因，我们设计了一个PCR底漆，用于解旋酶家族共有的基序序列（死亡等基序列I-VI），并试图从HELA细胞产生的CDNA库中扩增和收集PCR的候选基因片段。克隆分离的cDNA片段，并在某些部分进行核苷酸序列分析。但是，获得了许多出色的cDNA克隆片段，例如伸长因子，反映了文库中cDNA物种的偏见，因此很难找到稀有的cDNA物种。（2）因此，我们决定采用与（1）相比，我们采取不同的方法来隔离解旋酶家族。也就是说，我们目前正在尝试从确定整个碱基序列的酵母基因中鉴定出在解旋酶家族中保守的基因，并通过这些基因的基因破坏来分离新的解旋酶家族基因，从而通过蛋白质表达检查解旋酶活性，并通过同源搜索鉴定人类同源物。选择了八个新的基因，不包括已经鉴定为酵母中突变菌株的那些基因，并破坏了基因，并且发现至少五个Helicase家族基因至少对于至少五种而言至关重要。目前，我们正在考虑其生理功能和酶活性。（3）为了获得有关生物化学鉴定的解旋酶的主要结构（基序）的信息，我们与东京大学（Insomoto助理教授）的药学科学学院进行了小鼠DNA解旋酶B的主要结构分析。但是，通过使用多个cDNA文库或RT-PCR筛选，无法通过筛选来隔离人DNA解旋酶B。