ヒト細胞のDNA代謝に関与するヘリカーゼの探索と構造解析

(1)系統的なヒトヘリカーゼファミリー遺伝子を単離するために、ヘリカーゼファミリーに共通したモチーフ配列(DEAD等 motif I-VI)に対するPCR primerをデザインして、HeLa細胞より作製されたcDNAライブラリーからPCRによって候補遺伝子断片を増幅・回収することを試みた。単離されたcDNA断片をクローンし、一部につき塩基配列解析を行った。しかし、ライブラリー中のcDNA種の偏りを反映し、elongation factorなどabundantなcDNAクローン断片が数多く得られ、稀少なcDNA種を見出すことは困難であった。(2)そこでヘリカーゼファミリーの単離について、(1)とは別のアプローチを取ることに決めた。即ち、現在、その全塩基配列が決定されつつある酵母遺伝子からヘリカーゼファミリーに保存されたモチーフを持った遺伝子を同定し、これらの遺伝子の遺伝子破壊、蛋白質発現によるヘリカーゼ活性の検討、および相同性検索によるヒトホモログの同定を通じて、新たなヘリカーゼファミリー遺伝子を単離することを試みている。既に酵母で変異株などとして同定されたものを除く新規遺伝子8個を選び、遺伝子破壊を行った結果、少なくとも5個の増殖に必須なヘリカーゼファミリー遺伝子を見出している。現在、その生理的機能・酵素活性などについて検討している。(3)生化学的に同定されたヘリカーゼについてそれらの一次構造(モチーフ)情報を得るため、東大・薬学部(榎本助教授)と共同で、マウスDNAヘリカーゼBについてその一次構造解析を行った。しかし、ヒトDNAヘリカーゼBについては複数のcDNAライブラリーやRT-PCRなどによるスクリーニングでは単離することができなかった。

(1)系統的なヒトヘリカーゼファミリー遺伝子を単離するために、ヘリカーゼファミリーに共通したモチーフ配列(DEAD等 motif I-VI)に対するPCR primerをデザインして、HeLa細胞より作製されたcDNAライブラリーからPCRによって候補遺伝子断片を増幅・回収することを試みた。単離されたcDNA断片をクローンし、一部につき塩基配列解析を行った。しかし、ライブラリー中のcDNA種の偏りを反映し、elongation factorなどabundantなcDNAクローン断片が数多く得られ、稀少なcDNA種を見出すことは困難であった。(2)そこでヘリカーゼファミリーの単離について、(1)とは別のアプローチを取ることに決めた。即ち、現在、その全塩基配列が決定されつつある酵母遺伝子からヘリカーゼファミリーに保存されたモチーフを持った遺伝子を同定し、これらの遺伝子の遺伝子破壊、蛋白質発現によるヘリカーゼ活性の検討、および相同性検索によるヒトホモログの同定を通じて、新たなヘリカーゼファミリー遺伝子を単離することを試みている。既に酵母で変異株などとして同定されたものを除く新規遺伝子8個を選び、遺伝子破壊を行った結果、少なくとも5個の増殖に必須なヘリカーゼファミリー遺伝子を見出している。現在、その生理的機能・酵素活性などについて検討している。(3)生化学的に同定されたヘリカーゼについてそれらの一次構造(モチーフ)情報を得るため、東大・薬学部(榎本助教授)と共同で、マウスDNAヘリカーゼBについてその一次構造解析を行った。しかし、ヒトDNAヘリカーゼBについては複数のcDNAライブラリーやRT-PCRなどによるスクリーニングでは単離することができなかった。