真核細胞のDNA複製に関与するDNAヘリカーゼの探索

点击翻译按钮获取中文摘要

(1)DNAポリメラーゼalpha固相化カラムによる複製に関与するDNAヘリカーゼの同定について:ヒトDNAポリメラーゼと強固な複合体を形成し、DNA複製開始に必要なDNAプライマーゼと物理的に相互作用するヘリカーゼの検出を目指している。まずヒトDNAプライマーゼをコードする46,56kDa両サブユニットcDNAをヒトKB細胞cDNAライブラリーより単離・構造解析を行った。さらに固相化カラムの調製に必要な両蛋白質の過剰発現を目的として、大腸菌を宿主とする組み換えDNAの蛋白質発現を試みたが上手くいかなかった。現在、バキュロウイルス系による蛋白質発現を試みている。(2)DNAヘリカーゼファミリーの単離の試みについて:ヘリカーゼモチーフを持つ遺伝子(cDNA)の単離をめざして、2通りのPCRプライマー(モチーフIa<‐‐>II<‐‐>V)を設計して低いアニール温度(37度)にてcDNAライブラリーを鋳型にPCRを行った結果、1つのプライマー(II【tautomer】V)で約550bp付近に単一のバンドが検出できた。このバンドを単離してプロープとし、ヒトKB細胞cDNAライブラリーを現在スクリーニングしている。またPCRを用いるためにcDNA中の存在比に影響されるため、均衡化されたライブラリーの使用を検討している。(3)生化学的に同定されたヘリカーゼについてそれらの一次構造(モチーフ)情報を得るため、東大・薬学部(榎本助教授)と共同研究を行い、ヒトDNAヘリカーゼQ1についてはその染色体座位(12p12)を決定し、またヘリカーゼBについてマウスcDNAクローンの単離とその一次構造解析を行っている。