共焦点レーザ顕微鏡による蝸牛のイオン輸送の細胞分子生理学的研究

内耳の音受容には特異な電気的環境(+80〜+90正電位)とイオン環境(高Na^+、低Cl^-)を維持している血管条細胞と受容器細胞である有毛細胞のが主役を演じている。有毛細胞にはK^+、Ca^<2+>チャンネル、Na-H交換輸送、Cl-HCO_3交換輸送、血管輸送、血管条の辺縁細胞にはCl^-チャネル、K^+チャネル、非選択性陽イオンチャネル、P2リセプター、Naポンプが存在し重要な働きをしている。これらの機能蛋白の細胞、膜レベルでの細胞生物学的情報伝達系、相互作用、(クロストーク)、分子生物学的解析などの本質的研究を行ない、内耳の音受容の巧妙な機構を説明する各種イオン輸送蛋白の解明を行なった。1)チャンネル蛋白によるイオン輸送摘出した外有毛細胞と血管条に電位感受性色素や細胞内Ca^<2+>色素を負荷し、脱分極刺激による電位変化または細胞内Ca^<2+>濃度変化をリアルタイム共焦点レーザー顕微鏡を用いた顕微画像解析装置(現有設備)により設定し、Caチャネルやアゴニストの受容体の局在を解明された。2)担体蛋白によるイオン輸送摘出した外有毛細胞と血管条に電細胞内Ca^<2+>、Na^+、pH色素を負荷し細胞外のイオン組成を変えることによって種々の担体蛋白系(Naポンプ、Na-Ca交換輸送、Na-H交換輸送、Cl-HCO_3交換輸送Na-K-Cl共有送)を活性化して、リアルタイム共焦点レーザー顕微鏡を用いた顕微画像解析装置により測定し担体蛋白の局在を解明された。イオン輸送の局在とmRNAの発現機能の発現が同定されたチャンネル蛋白や担体蛋白の特異的構造ペプチド部位を合成する。合成ペプチドをウサギに免疫し抗血清を得て、蝸牛組織において免疫組織学的にその局在を調べた。イオン輸送をコードするcDNAをプローブとしてコルチ器と外側壁それぞれより採集したmRNAよりnorthern blot法でイオン輸送蛋白のmRNAを同定し、定量化した。さらに、そのcDNAプローブを作製して、蝸牛においてins situ hybridizationを行ない、発現細胞を同定した。

内耳の音受容には特異な電気的環境(+80〜+90正電位)とイオン環境(高Na^+、低Cl^-)を維持している血管条細胞と受容器細胞である有毛細胞のが主役を演じている。有毛細胞にはK^+、Ca^<2+>チャンネル、Na-H交換輸送、Cl-HCO_3交換輸送、血管輸送、血管条の辺縁細胞にはCl^-チャネル、K^+チャネル、非選択性陽イオンチャネル、P2リセプター、Naポンプが存在し重要な働きをしている。これらの機能蛋白の細胞、膜レベルでの細胞生物学的情報伝達系、相互作用、(クロストーク)、分子生物学的解析などの本質的研究を行ない、内耳の音受容の巧妙な機構を説明する各種イオン輸送蛋白の解明を行なった。1)チャンネル蛋白によるイオン輸送摘出した外有毛細胞と血管条に電位感受性色素や細胞内Ca^<2+>色素を負荷し、脱分極刺激による電位変化または細胞内Ca^<2+>濃度変化をリアルタイム共焦点レーザー顕微鏡を用いた顕微画像解析装置(現有設備)により設定し、Caチャネルやアゴニストの受容体の局在を解明された。2)担体蛋白によるイオン輸送摘出した外有毛細胞と血管条に電細胞内Ca^<2+>、Na^+、pH色素を負荷し細胞外のイオン組成を変えることによって種々の担体蛋白系(Naポンプ、Na-Ca交換輸送、Na-H交換輸送、Cl-HCO_3交換輸送Na-K-Cl共有送)を活性化して、リアルタイム共焦点レーザー顕微鏡を用いた顕微画像解析装置により測定し担体蛋白の局在を解明された。イオン輸送の局在とmRNAの発現機能の発現が同定されたチャンネル蛋白や担体蛋白の特異的構造ペプチド部位を合成する。合成ペプチドをウサギに免疫し抗血清を得て、蝸牛組織において免疫組織学的にその局在を調べた。イオン輸送をコードするcDNAをプローブとしてコルチ器と外側壁それぞれより採集したmRNAよりnorthern blot法でイオン輸送蛋白のmRNAを同定し、定量化した。さらに、そのcDNAプローブを作製して、蝸牛においてins situ hybridizationを行ない、発現細胞を同定した。