Toxicoproteomics: Veränderungen im Proteinmuster von Colonozyten nach Intoxikation mit clostridialen Zytotoxinen

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Die großen clostridialen Zytotoxine mono-glucosylieren Rho-Proteine und bewirken so eine Inaktivierung dieser essentiellen Regulatoren des Zytoskeletts und anderer zellulärer Funktionen wie Genregulation, Zell-Zyklus-Kontrolle und Zelltod. Die im Berichtszeitraum durchgeführten Arbeiten über die Wirkungen dieser Toxine auf das Proteom von Zielzellen zeigten, dass ca. 40 weitere Proteine Toxin-abhängig in ihrer zellulären Konzentration verändert werden. Auch eine katalytisch inaktive Toxinmutante ist in der Lage, das Proteinprofil der Zielzellen zu verändern. Durch die im Antragszeitraum geplanten Arbeiten soll ein noch besseres Verständnis der Toxinabhängigen Veränderungen im Proteom der Zielzellen erarbeitet werden, um ein Gesamtbild der zellulären Veränderungen zu erhalten. Dazu sind folgende Experimente geplant. A) die Proteomanalysen werden durch den Einsatz eines neuen hochauflösenden LC-MS-Systems verifiziert, B) die Proteine, deren Konzentrationen sich Toxin-abhängig verändern, werden in einen gerichteten LC-MS Proteomansatz quantifiziert; Kinetik und Konzentrations-Wirkungsbeziehungen sollen bestimmt werden, C) Signalwege, die nach Toxin-Behandlung über Rho (Wildtyp-Toxin) bzw. Rho-unabhängig (katalytisch inaktive Toxinmutante) zu Änderungen im Proteom führen, sollen aufgeklärt werden; hierfür wird das Kinom der Toxin-behandelten Zellen charakterisiert. Die Suche nach weiteren bakteriellen Faktoren, die neben den großen clostridialen Zytotoxinen an den zellulären Veränderungen beteiligt sind, schließt sich an. Dazu werden Colonzellen mit Kulturüberstand von Clostridium difficile oder mit intakten Bakterien (zelluläre Infektion) behandelt und die Auswirkungen auf das Proteom wird analysiert. Unterschiede im Vergleich zur Behandlung mit gereinigten Toxinen sollen herausgearbeitet werden und könnten Hinweise auf weitere unbekannte bakterielle Faktoren sein, die zusätzlich zu den bekannten Hauptpathogenitätsfaktoren ToxinA und B wirken.