枯草菌細胞壁結合複合リパーゼによる超高機能油脂分解菌体の創成

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細胞壁に結合させる蛋白として枯草菌分泌性リパーゼを選び、一方細胞壁結合ドメインは枯草菌細胞壁溶解酵素,CwlB,の細胞壁結合ドメインを使用した。構築した融合タンパクは細胞の表層に存在し、5MのLiClで抽出することができた。さらにこの抽出融合タンパクは塩濃度を下げると細胞壁に再吸着することがわかった。融合タンパクはリパーゼ活性を保持していたが、一方表層抽出液の中にはリパーゼ部分がなくなった細胞壁結合ドメインだけのものがモル比で等モル存在した。この結果から、表層においてもプロテアーゼの作用により分解が生じていると考えられる。一方培養上清中にはリパーゼ活性がまったく認められなかったことより、細胞壁より遊離したリパーゼは培養上溝中においてはさらに不安定で完全に分解されたものと思われる。そこで細胞壁結合性プロテアーゼWprAを欠損した株を作製し、2次元電気泳動法を用いて表層タンパク全体のスポットの変化を調べたところ、分解によるとみられるスポットが無くなり、代わりに高い分子量の位置に明確なスポットが認められた。そこでWpr欠損株で融合リパーゼタンパクを生産したところ、定常期において野生株のリパーゼ活性の低下が著しいのに対し、WprA変異株ではリパーゼ活性の減少が認められなかった。しかしSDS-PAGEではWpr欠損株においても融合リパーゼの分解が認められることより、さらに別のプロテアーゼにより分解を受けていると考えられる。