人工タンパク質の新規設計による細胞および抗体ターゲッティング機能分子の創製

通过人工蛋白质的新颖设计创建靶向功能分子的细胞和抗体

• 批准号: 10145244
• 负责人: 西野 憲和
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10145244/
• 关键词: ターゲッティング素子; 4α-ヘリックスバンドル構造; βαβα構造体; 細胞接着性機能; 抗体認識機能; 人工タンパク質

人工分子の基本骨格であるα-ヘリックスやβストランドを連結するループ部分に、細胞や抗体等から認識される部位を持つターゲッティング分子構築のため2種の人工タンパクを合成し評価した。まず、ループ部分に細胞接着性機能を有するRGDS配列を持つ4α-ヘリックスバンドル構造体を合成した。合成ペプチドをセファデックスG-50ゲルろ過カラムで精製し、凍結乾燥して標品を得た。各種条件下でCDおよび蛍光スペクトルを測定して構造体形成を調べた。このペプチドは水溶液中およびメタノール中でα-ヘリックス構造を示し、α-ヘリックス含率はメタノールの添加とともに増大した。二次構造の安定性をグアニジン塩酸塩による変性実験で調べたところC_<0.5>は5Mであった。また、このペプチドは水溶液中でピレンのモノマーおよびエキシマー発光が見られ、このエキシマー発光はメタノール中では消失した。これらの結果からこのペプチドはループ部分にXRGDSXという長い配列を持つにもかかわらず水溶液中で4α-ヘリックスバンドル構造を形成していることがわかる。しかしながらRGDSの領域が特定のコンホメーションを取っているかどうかは確認できなかった。このペプチドの水溶液中での安定性を調べるため、トリプシンを作用させたところ短い (D-Ala-Pro)ループ部分を持つ4α-ヘリックスバンドル構造ペプチドよりも早く分解を受けることがわかった。ループ部分の長さは4α-ヘリックスバンドル構造の安定性に影響を与えると考えられる。また、ループ部分にテトラエチレンオキシ鎖を有する4α-ヘリックスバンドル構造体も合成した。このペプチドも水溶液中でα-へリックス構造を示し、α-へリックス含率はメタノール添加しても一定であった。このα-へリックスの安定性をグアニジン塩酸塩による変性実験で調べたところC_<0.5>は約4Mであった。このペプチドは水溶液中でピレンのモノマーおよびエキシマー発光が見られ、このエキシマー発光はメタノール中では消失した。これらの結果からこのペプチドも水溶液中で4α-ヘリックスバンドル構造を形成していると思われ、ループ部分に自由度の高いテトラエチレンオキシ鎖を有していてもバンドル構造の形成に支障がないことがわかった。しかし、水溶液中でのトリプシンによる分解実験の結果RGDS配列を持つものと同様に早く分解を受けることがわかった。

Artificial molecules の basic skeleton で あ る alpha ヘ リ ッ ク ス や beta ス ト ラ ン ド を link す る ル ー プ part of に, cell や antibody か ら know さ れ る parts を hold つ タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ molecules to construct の た め two の artificial タ ン パ ク し を synthesis evaluation 価 し た. ま ず, ル ー プ part に cells then sexual function を す る RGDS match column を hold つ 4 alpha ヘ リ ッ ク ス バ ン ド ル constructs を synthetic し た. Synthesize ペプチドをセファデッ ス スG-50ゲ ろ ろ through カラムで refining て and freeze-drying て て standard を to obtain た. Under various conditions, でCDおよび蛍 light スペ ト ト を を is used to determine the を modulation べた of <s:1> て structure formation. こ の ペ プ チ ド は in aqueous solution, お よ び メ タ ノ ー ル で in alpha ヘ リ ッ ク ス tectonic を し, alpha ヘ リ ッ ク ス holdup は メ タ ノ ー ル の add と と も に raised large し た. Secondary construction <s:1> stability をグアニジ による salt-acid-salt による variation experiment で modulation べたと であった ろC_<0.5> をグアニジ 5Mであった. ま た, こ の ペ プ チ ド は in aqueous solution, で ピ レ ン の モ ノ マ ー お よ び エ キ シ マ ー 発 が of light ら れ, こ の エ キ シ マ ー 発 light は メ タ ノ ー ル in で は disappear し た. こ れ ら の results か ら こ の ペ プ チ ド は ル ー プ part に XRGDSX と い う い with long column を hold つ に も か か わ ら ず in aqueous solution, で 4 alpha ヘ リ ッ ク ス バ ン ド を ル structure form し て い る こ と が わ か る. し か し な が ら RGDS の domain specific の が コ ン ホ メ ー シ ョ ン を take っ て い る か ど う か は confirm で き な か っ た. こ の ペ プ チ ド の in aqueous solution, で の stability を adjustable べ る た め, ト リ プ シ ン を role さ せ た と こ ろ short い - Ala - Pro (D) ル ー プ part を hold つ 4 alpha ヘ リ ッ ク ス バ ン ド ル tectonic ペ プ チ ド よ り も early を く decomposition by け る こ と が わ か っ た. ル ー プ の partially さ は 4 alpha ヘ リ ッ ク ス バ ン ド の ル structure stability に influence を and え る と exam え ら れ る. ま た, ル ー プ part に テ ト ラ エ チ レ ン オ キ シ lock has す を る 4 alpha ヘ リ ッ ク ス バ ン ド ル constructs も synthetic し た. こ の ペ プ チ ド も で in the aqueous solution of alpha へ リ ッ ク ス tectonic を し, alpha へ リ ッ ク ス holdup は メ タ ノ ー ル add し て も certain で あ っ た. こ の alpha へ リ ッ ク ス の stability を グ ア ニ ジ ン salt acid salt に よ る - sex be 験 で adjustable べ た と こ ろ C_ < 0.5 > は about 4 m で あ っ た. こ の ペ プ チ ド は in aqueous solution, で ピ レ ン の モ ノ マ ー お よ び エ キ シ マ ー 発 が of light ら れ, こ の エ キ シ マ ー 発 light は メ タ ノ ー ル in で は disappear し た. こ れ ら の results か ら こ の ペ プ チ ド も で 4 in aqueous solution of alpha ヘ リ ッ ク ス バ ン ド を ル structure formation し て い る と think わ れ, ル ー プ part に high degrees of freedom の い テ ト ラ エ チ レ ン オ キ シ lock has し を て い て も バ ン ド の ル structure formed with に barrier が な い こ と が わ か っ た. し か し, aqueous solution of で の ト リ プ シ ン に よ る decomposition be 験 RGDS の results match column を hold つ も の と with others early に く decomposition を by け る こ と が わ か っ た.

项目成果

Kinya Tomizaki, Yoshikazu Kakimoto, Hideo Akisada, and Norikazu Nishino: "Substrate specificities of artificial flavo-enzymes" Peptides Proceedings of the 1st International Peptide Symposium. in press. (1999)

Kinya Tomizaki、Yoshikazu Kakimoto、Hideo Akisada 和 Norikazu Nishino：“人工黄素酶的底物特异性”第一届国际肽研讨会肽论文集。