チロシンリン酸化酵素関連分子の遺伝子ターゲティング法によるがん化分子機構の解析

利用酪氨酸激酶相关分子的基因靶向分析致癌的分子机制

基本信息

批准号：
10152259
负责人：
八木健
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10152259/
关键词：
Fyn Cadherin チロシンキナーゼ CNR

项目摘要

チロシンリン酸化活性は細胞の増殖、分化に重要な情報伝達系であり、細胞のがん化との関連性も示唆されている。本研究ではチロシンリン酸化酵素のFynが実際に細胞のがん化の過程でどの様に機能しているがを解析する目的で、Fyn結合分子の単離・解析を行った。本年度は特にFynと結合する細胞膜分子の同定を目的として研究を遂行した。(1)Fyn結合分子の解析。FynのN末端のSrcファミリー間で保存されていない領域、SH2、SH3をbait(餌)として、この領域と結合する分子を酵母2ハイブリッド系を用いて単離した。その結果、154クローンを得ることに成功した。この内、膜蛋白質を探索する目的で、全cDNAの塩基配列決定を行った。その結果、1クローンに疎水性アミノ酸クラスターが存在しており、膜蛋白質であることが予想された。このクローンの塩基配列を決定したところ、予想細胞外領域にカドヘリンモチーフが6回繰り返されており、新たなカドヘリン分子であることが明らかとなった。Fynと結合するカドヘリン様分子であることよりCNR1:cadherin-related neural receptor 1とした。(2)Fynとの結合能の解析。CNR1の細胞外領域でモノクローナル抗体を作製し、マウス脳のタンパク抽出液を用いてFynの抗体による免疫沈降を行った。その結果、FynとともにCNR1が共沈してくることが明らがとなった。この結果をより確かなものとするため、myc-tagを付けたFynの全長とCNR1の全長をHEK293細胞にcotransfectionして、myc抗体及びFyn抗体を用いて免疫沈降を行ったところ、両者ともにCNR1と共沈してくることが明らかとなった。(3)CNRファミリーの解析。CNR1がFynと結合する新規な受容体型分子であることより、相同な分子がファミリーとして存在していることを予想し、ゲノミックDNAを用いてサザンブロット法にて相同遺伝子の解析を行った。その結果、5'側のプローブを用いて約20本のバンドが確認された。これらの相同遺伝子の単離を行った結果、新たに7種類のcDNAの単離に成功した。これらの分子のタンパク質の構造を解析したところ、興味深いことにC末端の153アミノ酸配列が完全に一致していた。このアミノ酸配列にはPXXP配列が4箇所存在していることよりFynと結合する領域であることが想定される。本研究により、チロシンリン酸化酵素のFynと結合する新たなカドヘリン様受容体を得ることができた。また最近種々のがん細胞株での発現様式を解析した結果、一部のがん細胞で強発現が起こっていることより、CNRファミリーの強発現による正常な細胞間相互作用の阻害が考えられる。

酪氨酸磷酸化活性是细胞增殖和分化的重要信号系统，也有人建议与细胞癌有关系。在这项研究中，我们分离和分析了FYN结合分子，以分析酪氨酸磷酸化酶Fyn在细胞癌过程中的实际功能。今年，我们进行了专门进行研究，目的是鉴定与FYN结合的细胞膜分子。（1）FYN结合分子的分析。使用酵母两杂交系统分离了与该区域结合的分子，使用FYN，SH2和SH3的N端的SRC家族之间的未经保守区域作为诱饵。结果，我们成功获得了154个克隆。其中，将所有cDNA进行测序，目的是寻找膜蛋白。结果，一个克隆具有疏水性氨基酸簇，预计将是膜蛋白。当确定该克隆的碱基序列时，在预测的细胞外区域重复了钙粘蛋白基序，表明它是一种新的钙粘蛋白分子。因为它是与FYN结合的钙粘蛋白样分子，因此被指定为CNR1：cadherin与Fyn的结合能力分析。在CNR1的细胞外区域制备单克隆抗体，并使用FYN抗体中的小鼠大脑中的蛋白质提取物进行免疫沉淀。结果，发现CNR1与FYN一起重新沉淀。为了进一步确认这一结果，将带有MYC-TAG和CNR1的FYN的全长共转染到HEK293细胞中，并使用MYC和FYN抗体进行了免疫沉淀，并发现它们两个与CNR1共同沉淀。（3）CNR家族的分析。由于CNR1是一种与FYN结合的新型受体型分子，因此我们预测了一个家族中存在同源分子，并使用Southern使用基因组DNA分析了同源基因。结果，使用5'探针确认了大约20个频段。由于分离了这些同源基因，成功分离了七种新型的cDNA。当分析这些分子的蛋白质结构时，有趣的是，C-末端处的153个氨基酸序列已完全匹配。由于该氨基酸序列中有四个PXXP序列，因此假定它是与FYN结合的区域。这项研究使创建了与酪氨酸磷酸化酶Fyn结合的新的钙粘蛋白样受体。此外，最近分析了各种癌细胞系中的表达模式，由于CNR家族的强表达，某些癌细胞的强表达可能会抑制正常细胞 - 细胞相互作用。