チロシンリン酸化酵素関連分子の遺伝子ターゲティング法によるがん化分子機構の解析

利用酪氨酸激酶相关分子的基因靶向分析致癌的分子机制

• 批准号: 10152259
• 负责人: 八木 健
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10152259/
• 关键词: Fyn; Cadherin; チロシンキナーゼ; CNR

チロシンリン酸化活性は細胞の増殖、分化に重要な情報伝達系であり、細胞のがん化との関連性も示唆されている。本研究ではチロシンリン酸化酵素のFynが実際に細胞のがん化の過程でどの様に機能しているがを解析する目的で、Fyn結合分子の単離・解析を行った。本年度は特にFynと結合する細胞膜分子の同定を目的として研究を遂行した。(1)Fyn結合分子の解析。FynのN末端のSrcファミリー間で保存されていない領域、SH2、SH3をbait(餌)として、この領域と結合する分子を酵母2ハイブリッド系を用いて単離した。その結果、154クローンを得ることに成功した。この内、膜蛋白質を探索する目的で、全cDNAの塩基配列決定を行った。その結果、1クローンに疎水性アミノ酸クラスターが存在しており、膜蛋白質であることが予想された。このクローンの塩基配列を決定したところ、予想細胞外領域にカドヘリンモチーフが6回繰り返されており、新たなカドヘリン分子であることが明らかとなった。Fynと結合するカドヘリン様分子であることよりCNR1:cadherin-related neural receptor 1とした。(2)Fynとの結合能の解析。CNR1の細胞外領域でモノクローナル抗体を作製し、マウス脳のタンパク抽出液を用いてFynの抗体による免疫沈降を行った。その結果、FynとともにCNR1が共沈してくることが明らがとなった。この結果をより確かなものとするため、myc-tagを付けたFynの全長とCNR1の全長をHEK293細胞にcotransfectionして、myc抗体及びFyn抗体を用いて免疫沈降を行ったところ、両者ともにCNR1と共沈してくることが明らかとなった。(3)CNRファミリーの解析。CNR1がFynと結合する新規な受容体型分子であることより、相同な分子がファミリーとして存在していることを予想し、ゲノミックDNAを用いてサザンブロット法にて相同遺伝子の解析を行った。その結果、5'側のプローブを用いて約20本のバンドが確認された。これらの相同遺伝子の単離を行った結果、新たに7種類のcDNAの単離に成功した。これらの分子のタンパク質の構造を解析したところ、興味深いことにC末端の153アミノ酸配列が完全に一致していた。このアミノ酸配列にはPXXP配列が4箇所存在していることよりFynと結合する領域であることが想定される。本研究により、チロシンリン酸化酵素のFynと結合する新たなカドヘリン様受容体を得ることができた。また最近種々のがん細胞株での発現様式を解析した結果、一部のがん細胞で強発現が起こっていることより、CNRファミリーの強発現による正常な細胞間相互作用の阻害が考えられる。

Cell proliferation and differentiation are important information sources for cell growth and differentiation. In this study, we aimed to analyze the function of Fyn in the process of cell transformation, and analyze the isolation of Fyn binding molecules. This year's study was conducted on the molecular identity of Fyn. (1) Analysis of Fyn binding molecules. The N-terminal region of Fyn is preserved in the middle of the domain, SH2, SH3, bait, and domain binding molecules. The result was 154. The aim of this study is to determine the nucleotide sequence of the whole cDNA. As a result, the water content of the membrane protein was reduced to 100%. The base arrangement of the protein is determined by the number of molecules in the extracellular domain. CNR1:cadherin-related neural receptor 1 (2) Analysis of binding energy of Fyn. The extracellular domain of CNR1 is controlled by Fyn antibody. The result is that Fyn and CNR1 are sinking together. The results showed that the total length of Fyn and the total length of CNR1 in HEK293 cells were co-transfected with myc antibody and Fyn antibody. (3)CNR analysis. CNR1, Fyn and Fyn are new receptor molecules, and the same molecules exist in the same way. The analysis of the same molecules is carried out by using the same DNA method. The results, 5'side of the box, were confirmed by about 20 entries. The same cDNA fragments were successfully isolated from 7 new species. The structure of the molecule is analyzed and the acid alignment of the C-terminal is completely consistent. The PXXP alignment is composed of four elements. In this study, we found a new receptor for the enzyme Fyn. The analysis of the expression pattern of the most recent cell lines, the study of the inhibition of normal cell-cell interactions in the strong expression of some of the cells, and the study of the strong expression of CNR.