分裂酵母複製開始点に結合する核蛋白質複合体

与裂殖酵母复制起点结合的核蛋白复合物

• 批准号: 10159211
• 负责人: 升方 久夫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10159211/
• 关键词: 染色体機能領域; 真核生物DNA複製; 複製開始点認識; 複製開始制御; 細胞周期; DNA-蛋白質相互作用

(1) 分裂酵母の複製開始点認識複合体(ORC)構成因子と考えられるOrplにFLAG-タグ融合蛋白質として分裂酵母細胞で発現させ、抗FLAG抗体を用いて回収した免疫沈降画分にOrp2pとOrp5pを検出した。またFLAG-Orp2を発現する株からのFLAG抗体免疫沈降によりOrp1pとOrp5pを検出した。よって、Orplp-Orp2p-Orp5pは細胞内で複合体を形成すると考えられる。(2) FLAG-Orpl免疫沈降画分が試験管内で分裂酵母ars2004断片に特異的に結合することを見出した。FLAG-Orp2画分も同様の結合活性を示した。よって、分裂酵母ORCはars2004に結合すると結論した。この結合反応はars2004内の必須領域IとIIIに特異的である。FLAG-Orpl画分は細胞内でars2004プラスミドの複製必須領域Iの機能を置換できるdA40/dT40やd(AAAT)10/d(TTTA)10に結合し、機能を置換できないd(AAAC)10/d(TITG)10は結合しないことから、ORCの結合が複製開始に必須であると考えられる。アデニン(チミン)連続配列が分裂酵母ORCの認識配列であると推測されるが、分裂酵母ORCの認識の塩基配列特異性は低いと考えられる。(3) 細胞内からFLAG-Orpl蛋白質とDNAとの複合体をFLAG抗体により回収し、PCR増幅を行うクロマチン免疫沈降法(CHIP法)により、Orpl蛋白が染色体上の複製開始点ars2004の必須領域を含む狭い範囲に結合していることを示した。 (4)MCMファミリーに属するMis5(MCM6)蛋白が細胞周期のGl期からS期にのみ、複製開始点ars2004に結合することをCHIP法により確認した。

(1)The ORC component of the yeast is detected by ORP2 and ORP5 fusion protein, and the anti-FLAG antibody is detected by ORP2 and ORP5 fusion protein. Flag-Orp2 is detected in plants with Flag-antibody immune sedimentation, Orp1p and Orp5p are detected. Orplp-Orp2p-Orp 5 p-Orp 2p-Orp5 p-Orp 5 p-Orp 6 p-Orp 5 p-Orp 6-Orp-Orp 5 p-Orp-Orp 2p-Orp- (2)FLAG-Orpl immunoprecipitation assay was used to detect the specific binding of the split yeast ars2004 fragment in the assay tube. FLAG-Orp2 shows the same binding activity. The results showed that ORC 2004 had a positive effect on the growth of yeast. This combination of anti-ars 2004 must be in the field I and III specific. FLAG-Orpl is divided into two parts: intracellular ars2004, replication required domain I, functional replacement, binding, functional replacement, binding, ORC, replication required domain I, functional replacement, binding, ORC, replication required domain I, functional replacement, binding, functional replacement, binding, ORC, replication required domain I, functional replacement, binding. The nucleotide sequence of ORC in S. cerevisiae was lower than that of ORC in S. cerevisiae. (3)FLAG-Orpl protein and DNA complex in cells FLAG antibody, PCR amplification, immunoprecipitation method (CHIP method), Orpl protein, replication start point on chromosome ars2004, essential domain, narrow range binding, etc. (4) MCM6 protein belongs to Mis5 (MCM6), which is confirmed by CHIP method.

项目成果

Y.Ogawa: "Association of autonomous replication activity with replication origins in a human chromosome." Exp.Cell Res.243. 50-58 (1998)

Y.Okawa：“自主复制活动与人类染色体复制起点的关联。”

C.Obuse.: "Interaction of transcription factor YY1 with a replication-enhancing element, REE1, in an autonomously replicating human chromosome fragment." Nucle.Acids Res.26. 2392-2397 (1998)

C.Obuse.：“转录因子 YY1 与复制增强元件 REE1 在自主复制的人类染色体片段中的相互作用。”