ヒト染色体上の複製開始点と自律複製領域(ARS)の解析

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我々は約10kb毎のヒト染色体を大腸菌プラスミドpUC119に組み込んだライブラリーをヒト培養細胞293Sに導入し、5-ブロモデオキシウリジン(BrdU)存在下で約2細胞世代培養した後、エピゾーマル分画のDNAを回収し、二重鎖DNAの両鎖ともにBrdUを取り込んだ分子を大腸菌に回収した。この操作を2回繰り返すことにより、自律複製すると思われる染色体断片(ARS)を得た。これらについて、ヒト細胞に導入した性質を詳しく調べたところ、半保存的複製をする、染色体に組み込まれず複製する、細胞周期のS期にただ一度複製する等、自律複製することを確認した(投稿中)。次に、得られたARS断片の末端から約300bpずつ系統的に欠失させたデイリーション株を作成しその複製能を調べた結果、10.2kb断片内に少なくとも2ケ所複製能に影響を与える領域を同定した。欠失によりARS断片の複製能の4割が失われる領域について、さらに細かなデイリーション株、及び6塩基置換株の解析から、23bpの必要な領域を特定することができた。従ってヒト染色体断片のARSとしての複製に特定の塩基配列が関与することが示された(投稿準備中)。また、PCR法を用いて新生DNA鎖のマッピングを行うことにより、ARSプラスミド上の複製開始を決定した結果、上記の必要領域を含む約3kbの領域内から複製が開始していることも明らかとなった。これらの結果をあわせると、上記の複製に必要な領域は直接複製開始に関与するoriginである可能性が高いと考えられる。