ヒト染色体上の複製開始点と自律複製領域(ARS)の解析

人类染色体上的复制起点和自主复制区 (ARS) 分析

• 批准号: 04833009
• 负责人: 升方 久夫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04833009/
• 关键词: ヒト染色体; 複製開始; 自律複製配列; 染色体外因子; 密度標識法

我々は約10kb毎のヒト染色体を大腸菌プラスミドpUC119に組み込んだライブラリーをヒト培養細胞293Sに導入し、5-ブロモデオキシウリジン(BrdU)存在下で約2細胞世代培養した後、エピゾーマル分画のDNAを回収し、二重鎖DNAの両鎖ともにBrdUを取り込んだ分子を大腸菌に回収した。この操作を2回繰り返すことにより、自律複製すると思われる染色体断片(ARS)を得た。これらについて、ヒト細胞に導入した性質を詳しく調べたところ、半保存的複製をする、染色体に組み込まれず複製する、細胞周期のS期にただ一度複製する等、自律複製することを確認した(投稿中)。次に、得られたARS断片の末端から約300bpずつ系統的に欠失させたデイリーション株を作成しその複製能を調べた結果、10.2kb断片内に少なくとも2ケ所複製能に影響を与える領域を同定した。欠失によりARS断片の複製能の4割が失われる領域について、さらに細かなデイリーション株、及び6塩基置換株の解析から、23bpの必要な領域を特定することができた。従ってヒト染色体断片のARSとしての複製に特定の塩基配列が関与することが示された(投稿準備中)。また、PCR法を用いて新生DNA鎖のマッピングを行うことにより、ARSプラスミド上の複製開始を決定した結果、上記の必要領域を含む約3kbの領域内から複製が開始していることも明らかとなった。これらの結果をあわせると、上記の複製に必要な領域は直接複製開始に関与するoriginである可能性が高いと考えられる。

We introduced about 10kb of each chromosome into E. coli pUC119 and cultured about 2 generations of cells in the presence of BrdU. The operation of the chromosome fragment (ARS) is carried out in two cycles. The nature of cell introduction is detailed, and semi-preserved replication is confirmed. Chromosome organization is replicated, and the S phase of the cell cycle is replicated. In addition, the end of the ARS fragment is about 300bp. The replication energy of the system is adjusted. The replication energy of the 10.2 kb fragment is equal to that of the field. The 4-segment deletion of ARS fragment was detected in the domain, and the 23-bp required domain was identified in the analysis of the 6-bp mutant strain and the 6-bp mutant strain. The specific gene alignment of chromosome fragments is related to replication (preparation for submission). The PCR method is used to determine the start of replication in the newly generated DNA lock, and the necessary domain is included in the 3kb domain. The result of this is that the necessary field of replication is directly related to the origin of the product.