尿中近位尿細管刷子緑膜小胞を用いたイオン輸送解析系の確立

尿近端肾小管刷绿膜囊泡离子转运分析系统的建立

• 批准号: 10877163
• 负责人: 根東 義明
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10877163/
• 关键词: 腎尿細管; 細胞膜小胞体; 尿中落下物質

これまで、尿中に落下した腎尿細管細胞を培養系に移し、培養された各種の細胞系を利用して細胞内での遺伝子メッセージの発現や、たんぱく質の発現などを検討してきた。今回は、この仕事の上に立ち、さらに尿中に多数浮遊している事が推測されている破砕細胞膜片の小胞体構造が、研究対象となり得るかどうかに関しての検討を進めた。まず、正常ヒト尿を通常の方法で採取し、それらを摂氏4度にて、通常遠心機を用いて2000回転で15分遠心し、その上清を分離後、超遠心10万gにて30分施行した。その上清は破棄し、残ったペレットをホモジナイザーを用いて粉砕し、アイソレーションバッファーとしてD-mannnitol、EGTA、Trisバッファーph7.4に再度懸濁し、Mgを用いて細胞膜分画だけを再度同様の超遠心にて沈殿させた。当初、文献(BBA647:169-176,1981とAm J Physiol F61-68,1996)に記載された方法を用いて、通常の組織片からの小胞の分離を想定し、初期遠心後の上清をポリトロンにより破砕し、細胞膜成分の中でも、サイズの大きい分画の処理を進めてみたが、残念ながら超遠心後の膜成分の回収が著しく悪く、最終的なMg沈澱処理後の小胞体の回収はほとんどゼロの状況で、そのままでは研究対象として扱えない事が明らかとなった。このため、方法論を再検討した結果、上述のように細胞膜のポリトロンによる破砕を省略し、生成を進めた結果、最終産物に細胞膜成分と思われる小胞体構造を得る事が出来た。さらにこの方法を簡略化し、小胞体の回収率を上げるために、当初の採取尿に直接Mgを加える手法を導入したところ、回収率は、最高となった。しかしながら、実際に回収された小胞体ペレットは、全尿100mlから、蛋白成分量にしても1mgにはほとんど到達せず、残念ながら今回の検討結果からは、高度に感受性のある抗体などで、存在する蛋白を同定する場合には利用可能と考えられるものの、腎組織より直接精製した小胞体で行われる膜輸送機能の検討に供するためには、大量の採尿が必要と考えられた。今後、微小サンプルでの輸送機能検討方法の確立が前提と考えられる。

到目前为止，掉入尿液中的肾小管细胞已转移到培养系统中，并且已经使用了各种培养的细胞系来检查细胞中基因信息的表达和蛋白质表达。这次，我们一直在处理这项任务，还研究了破坏的细胞膜片段的内质网状结构，这些结构是否可能是尿液中漂浮的，这可能是研究的主题。首先，通过正常方法收集正常的人尿液，并使用正常离心机在2,000 rpm下在4°C离心15分钟，然后将上清液分离，然后在100,000 g上进行超速切除30分钟。将上清液丢弃，使用均质器将其剩余的沉淀物重悬于D-甘露醇，EGTA，EGTA，TRIS Buffer pH 7.4作为分离缓冲液中，仅使用MG再次通过同一超偏见来再次沉淀细胞膜馏分。最初，使用文献中描述的方法（BBA647：169-176,1981和AM J Physiol F61-68,1996），我们假设将囊泡从正常组织中分离出来，并在初始离心后的上网后进行了polytron中断，并通过Polytron中断了，我们继续进行了大量的细胞组合。不幸的是，超速离心后的膜成分的恢复明显较差，并且在最终MG沉淀处理后的内质网的恢复几乎为零，并且揭示了它不能像IS一样被视为研究对象。因此，由于上述方法的重新审查，通过多龙的破坏省略了细胞膜，并进行了形成，因此，获得了最终产物以获得似乎是细胞膜成分的内质网结构。此外，为了简化此方法并提高内质网的恢复速率，引入了一种直接将MG添加到原始采样尿液中的方法，并且回收率最高。然而，即使在100 mL总尿液中的蛋白质成分量中，实际回收的内质网骨也几乎没有达到1 mg，而且不幸的是，这项研究结果表明，尽管认为它们可以用来识别具有高度敏感抗体的蛋白质，但它们并不是从高度敏感的抗体中，但它们不考虑较大的膜的固定量，而在膜上构成了较大的固定型固有液体，这些蛋白质均可固定在纤维化的范围内，固有的固有液体固有液体，这些蛋白质的固有液体固有液体的固有液体，这些蛋白质的固有液体均可固定液体，这些蛋白质的固有液体固有液体的固有液体，并且是必要的。人们认为前提是建立一种将来研究运输功能的方法。