複製開始蛋白質DnaAのX線結晶構造解析による高次構造の決定と機能部位解析

通过复制起始蛋白 DnaA 的 X 射线晶体结构分析确定高阶结构和功能位点分析

基本信息

批准号：
11143209
负责人：
黒田照夫
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11143209/
关键词：
DNA複製癌開始因子 ATP結合 ATPase DnaA ORC Cdc6p

项目摘要

1、試験管内でDnaAを活性化する因子として、酸性リン脂質が知られている。我々はDnaA蛋白質の372番目のリジンが、膜リン脂質と相互作用することを見出した。さらにを遺伝学的解析から、このアミノ酸に変異を持つDnaAが、細胞内で機能することを見出した。2、我々は既に、複製された直後の再複製開始制御にDnaAのATPaseが関与していることを報告している。本年度、我々はこのATPaseの促進因子を発見し、遺伝学的にそれがDNAポリメラーゼのβサブユニットであることを見出した。3、我々はこれまでDnaAの種々の活性に預かる機能ドメインの決定を行ってきた。その結果、DnaA同士の相互作用に預かる機能ドメイン以外はすべてその決定に成功した。一方、DnaAのN末端部位の機能も未解明であった。我々はDnaA蛋白質のN末端の疎水性のアミノ酸残基が多くの原核生物でよく保存されていること、及びそのアミノ酸群が、ロイシンジッパー様構造(蛋白質の重合に関与)をとることを発見し、N末端がDnaA蛋白質同士の相互作用に関与していると考え、その証明に成功した。4、真核生物の染色体DNA複製開始の最初の段階であり、且つ律速段階であるORCとCdc6pの相互作用ですら、これまでその試験管内再構成系は確立されておらず、複製開始制御機構の解明を困難にしてきた。本年度我々は、そのOCRとCdc6pの相互作用の試験管内再構成に世界で始めて成功した。そしてその再構成系を使い、その相互作用がDNA依存であることなどを明らかにした。5、ORCのATPaseが、ORCのCdc6pとの結合を負に制御していること、すなわち再複製開始を制御していることを見出した。一方、Cdc6pのATPaseに関しては、ORCがoriginに特異的に結合するのを促進するという機能を果たしていることを発見した。

1。酸性磷脂被称为激活测试管中DNAA的因素。我们发现DNAA蛋白第372位的赖氨酸与膜磷脂相互作用。此外，遗传分析表明，该氨基酸中具有突变的DNAA在细胞中起作用。 2，我们已经报道了DNAA的ATPase在复制后立即参与复制起始控制。今年，我们发现了这个ATPase促进因子，并从遗传上发现它是DNA聚合酶的β亚基。 3。我们以前已经确定了受DNAA各种活性的功能域。结果，成功确定了DNAA之间相互作用中存在的所有功能域。另一方面，也没有阐明DNAA的N末端位点的功能。我们发现，DNAA蛋白N末端的疏水性氨基酸残基在许多原核生物中都很好地保守，并且它们的氨基酸基团具有类似亮氨酸拉链样结构（涉及蛋白质聚合），我们成功地证明了这一点。 4。即使是在真核生物中染色体DNA复制的第一阶段和限制速率限制步骤的第一阶段，也没有在体外重建系统中建立，这也是难以阐明复制起始控制机制。今年，我们是世界上第一个成功地重建OCR和CDC6P之间的相互作用的人。然后使用重建系统来揭示相互作用是DNA依赖性的。 5。我们发现ORC ATPase负面控制ORC与CDC6P的结合，即控制重新复制的起始。另一方面，我们发现ORC的功能是促进CDC6P ATPase中特定结合的特定结合。