パッチクランプ法による細菌細胞のイオン輸送系の包括的解析

利用膜片钳法综合分析细菌细胞离子传输系统

基本信息

批准号：
16013233
负责人：
黒田照夫
金额：
$ 3.78万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16013233/
关键词：
パッチクランプ法多剤排出ポンプイオン輸送系

项目摘要

1.多剤排出ポンプの大量発現プラスミドの作成と大量発現及び活性測定アラビノースプロモーターを用いた大量発現系を構築できた。通常細胞では問題なく発現させることができるが、巨大プロトプラストでは、発現させると細胞膜の脆弱さがさらに進む、あるいはパッチクランプ法に適用できるほど巨大化できない、など不具合が生じた。条件検討をさらに重ね、ようやく活性測定できる態勢は整えることはできたが、活性を捉えるにはいたっていない。またリポソームへの再構成後、そのリポソームを巨大化させるという別の観点からのアプローチも急遽進めている。2.新規多剤排出ポンプ遺伝子のクローニング肺炎桿菌、腸炎ビブリオ、non-01コレラ菌、緑膿菌、セラチア、黄色ブドウ球菌から、機能相補の面及び一次構造の類似性の面から多剤排出ポンプ遺伝子をクローニングした。合計30種程度の新規多剤排出ポンプについて現在解析を行っており、そのうち半数以上がすでに解析を終了している(投稿準備中)。またNa^+/H^+アンチポーターについても解析を行った(Kuroda(2004))。3.大腸菌巨大プロトプラストにおける遺伝子発現プロファイルの解析パッチクランプ法による解析をさらに行いやすくするために、大腸菌巨大プロトプラストにおける遺伝子発現プロファイルを解析した。現在詳細なデータ解析を行っており、その結果を基に巨大化法の改善策などを決定する。4.黄色ブドウ球菌の巨大化及びパッチクランプ法による活性測定グラム陰性菌である大腸菌だけでなく、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌で巨大化の方法を新たに見出した。そして呼吸鎖、F-type ATPaseの活性をパッチクランプ法で捉えることに成功した(投稿準備中)。さらに細菌細胞よりも解析が進んでいる酵母についてパッチクランプ法による解析を行った(Kuroda(2004))。

1。创建用于多重外排泵的大规模表达质粒，并测量大规模表达和活性，可以构建使用阿拉伯糖启动子的大规模表达系统。尽管可以在正常细胞中没有任何问题来表达，但在巨型原生质体中，细胞膜的表达变得更加脆弱，或者不可能变得足够大，无法应用于斑块夹紧。经过进一步检查条件，我们最终能够做好准备以衡量活动，但是我们无法掌握活动。我们还从重建脂质体然后增加脂质体大小的其他角度从其他角度开始采用快速方法。 2。新型多饮出泵基因的克隆，从克雷伯菌肺炎，弧菌parahaemolyticus，non-01 cholerae，p. p. eruginosa，eruginosa，ernoginosa，ersatia，seratia，seratia和葡萄球菌aureus caphyloccus aureus在功能上的众多结构方面相似。目前，我们正在进行总共约30个新的多药污水泵的分析，其中一半以上已经完成了他们的分析（以准备发布）。我们还分析了Na^+/H^+抗孢子（Kuroda（2004））。 3。分析巨型大肠杆菌原生质体中基因表达谱分析，以进一步促进分析，分析巨型大肠杆菌原生质体中的基因表达谱。我们目前正在进行详细的数据分析，并基于结果，我们将决定改善巨型化方法的方法。 4。通过斑块夹紧方法测量金黄色葡萄球菌的巨型化和活性，一种新的方法，不仅在大肠杆菌（革兰氏阴性细菌）中，而且在金黄色葡萄球菌中，一种革兰氏阳性细菌。我们还使用贴片夹方法（准备发布），成功地捕获了呼吸链F型ATPase的活性。此外，通过斑块夹法（Kuroda（Kuroda（2004）））分析了比细菌细胞更高分析的酵母菌。