パッチクランプ法による細菌細胞のイオン輸送ネットワークの解析

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1、パッチクランプ法による活性測定(モデル系の確立)モデル系として選択した大腸菌Na^+-セリン共輸送系SstTについては、発現量がうまく制御できず、有意な活性は得られなかった。大腸菌多剤排出ポンプAcrAB-TolCは巨大プロトプラストにおいてもその活性に外膜成分が必須であることが示唆され、こちらも活性測定できなかった。現在、2でその準備が整いつつある大腸菌多剤排出ポンプMdfAについて系を確立する予定である。2、大量発現プラスミドの構築上記MdfAと黄色ブドウ球菌多剤排出ポンプNorAについて大量発現プラスミドを構築した。その最滴な発現条件を検討した。この中でもMdfAについてが最も進んでいるが、発現量を大幅に上昇させると、巨大プロトプラストの大きさが小さくなってしまい、パッチクランプ法を適用するには難しいという状況になっている。今後、いくつかの条件を検討し、発現量が十分かつ巨大プロトプラストの大きさも十分であるという条件を見出していく。3、機能未知膜タンパク質の遺伝子クローニング多剤排出ポンプについては今年度、計13個の新規遺伝子をさまざまな細菌の染色体DNAからクローニングし、その解析を進めた。特筆すべきはこのうち、実に5種類がABC familyに属するものであるということである。現在まで細菌細胞の多剤排出ポンプのうち、ABC familyに属するものは3種類しか報告されておらず、細菌細胞にはあまりこのfamilyに属するものは存在しないのではないかとも考えられていた。しかし本研究により、今までクローニングをすることが困難であったために見つかっていないだけで、実際に少ないわけではないことが予想された。また大腸菌で発現させても活性が無いものなどもいくつか存在し、それらについても今回いくつかその性質を解析した。この中のいくつかについては、解析の結果、興味深い性質を有しているので、上記2を経てパッチクランプ法による測定を行うことを計画している。一方、多剤排出ポンプ以外についてもイオン輸送ネットワークにおいて重要な役割を担っているNa^+/H^+アンチポーターのクローニングを行い、その性質についても解析した。