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パッチクランプ法による細菌細胞のイオン輸送ネットワークの解析

膜片钳法分析细菌细胞内的离子传输网络

基本信息

批准号：
15013239
负责人：
黒田照夫
金额：
$ 3.52万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1、パッチクランプ法による活性測定(モデル系の確立)モデル系として選択した大腸菌Na^+-セリン共輸送系SstTについては、発現量がうまく制御できず、有意な活性は得られなかった。大腸菌多剤排出ポンプAcrAB-TolCは巨大プロトプラストにおいてもその活性に外膜成分が必須であることが示唆され、こちらも活性測定できなかった。現在、2でその準備が整いつつある大腸菌多剤排出ポンプMdfAについて系を確立する予定である。2、大量発現プラスミドの構築上記MdfAと黄色ブドウ球菌多剤排出ポンプNorAについて大量発現プラスミドを構築した。その最滴な発現条件を検討した。この中でもMdfAについてが最も進んでいるが、発現量を大幅に上昇させると、巨大プロトプラストの大きさが小さくなってしまい、パッチクランプ法を適用するには難しいという状況になっている。今後、いくつかの条件を検討し、発現量が十分かつ巨大プロトプラストの大きさも十分であるという条件を見出していく。3、機能未知膜タンパク質の遺伝子クローニング多剤排出ポンプについては今年度、計13個の新規遺伝子をさまざまな細菌の染色体DNAからクローニングし、その解析を進めた。特筆すべきはこのうち、実に5種類がABC familyに属するものであるということである。現在まで細菌細胞の多剤排出ポンプのうち、ABC familyに属するものは3種類しか報告されておらず、細菌細胞にはあまりこのfamilyに属するものは存在しないのではないかとも考えられていた。しかし本研究により、今までクローニングをすることが困難であったために見つかっていないだけで、実際に少ないわけではないことが予想された。また大腸菌で発現させても活性が無いものなどもいくつか存在し、それらについても今回いくつかその性質を解析した。この中のいくつかについては、解析の結果、興味深い性質を有しているので、上記2を経てパッチクランプ法による測定を行うことを計画している。一方、多剤排出ポンプ以外についてもイオン輸送ネットワークにおいて重要な役割を担っているNa^+/H^+アンチポーターのクローニングを行い、その性質についても解析した。

1. Activity determination (establishment of the system) of Escherichia coli Na^+-co-transport system SstT, detection amount, control and intentional activity determination. E. coli multi-agent excretion AcrAB-TolC is a major factor in determining the activity of outer membrane components. Now, 2. Prepare for the adjustment of coliform multiple excretion. MdfA is prepared to establish a predetermined system. 2, a large number of development of the structure of the MdfA and yellow bacteria multi-agent discharge of the NorA, a large number of development of the structure of the The most important condition for development is discussed. In this case, MdfA is the most advanced, and the amount of discovery has increased significantly. In this case, the large number of large-scale projects is small, and the large number of large-scale projects is difficult. In the future, the conditions for the development of the project will be discussed, and the amount of development will be very large. 3. The function of the unknown membrane is unknown. This year, there are 13 new genes. The chromosome DNA of bacteria is analyzed. 5 kinds of ABC family Now, bacterial cells have many different kinds of effluents. ABC family members have different kinds of effluents. Bacterial cells have different kinds of effluents. This research is very difficult, but it's very difficult. Coliform bacteria are found in different activities, and their properties are analyzed. In this case, the analysis result, the interesting property, the determination method, the plan, and the calculation method are described above. One side, multi-agent discharge, transfer, important service, Na^+/H^+ discharge, transfer, analysis