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パッチクランプ法を用いた細菌細胞のイオン輸送タンパク質の網羅的解析

膜片钳法综合分析细菌细胞内离子转运蛋白

基本信息

批准号：
14014234
负责人：
黒田照夫
金额：
$ 3.84万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14014234/
关键词：
パッチクランプ法多剤排出ポンプイオン輸送タンパク質

项目摘要

1、イオン輸送タンパク質の大量発現プラスミドの作成と大量発現-大腸菌Na^+-セリン共輸送タンパク質SstT及びコレラ菌ATP駆動型多剤排出ポンプVcaMの大量発現プラスミドを構築した。前者についてはこれを基に精製・再構成を行いその性質について解析をおこなった(Kim 2002)。後者については予想ほど大量発現ができておらず、現在プラスミドの再構築を検討している。2、機能未知膜タンパク質の遺伝子クローニング-10種の新規多剤排出ポンプの遺伝子を黄色ブドウ球菌、緑膿菌、セラチア、セパシアなどからクローニングし解析を行った(Cheng 2003, Lee 2003)。3、パッチクランプシステムの構築-購入したデータレコーダーを組み合わせ、パッチクランプシステムを立ち上げた。4、パッチクランプ法による測定-大腸菌Na^+セリン共輸送系であるSstTの輸送活性をパッチクランプ法により測定した。さまざまな条件検討を重ねたが、現在までのところ、有意な輸送活性を捉えることはできていない。この原因として、SstTの発現量がまだ不足している、用いている大腸菌の細胞膜が特に脆弱である、などの理由が挙げられる。上記SstTと共に、大腸菌多剤排出ポンプAcrABの活性をパッチクランプ法によって測定した。これはSstTで有意な活性が得られていない理由の一つが発現量が少ないことであり、AcrABの場合、特別な大量発現プラスミドを構築しなくとも十分量のタンパク質が発現しているからである。こちらも活性は捉えられていないが、条件検討を重ねれば活性を捉えることができると考えられる結果を得ている。

1. Construction of mass production solution for mass production of E. coli Na^+-E. coli co-transport solution SstT and E. coli ATP motion-type multi-agent efflux solution VcaM The former contains the basic elements, refined elements and re-structured elements, and the latter contains the properties, analyzed elements and re-structured elements (Kim 2002). In the latter case, we want to discuss the re-construction of a large number of projects. 2. Gene transfer of unknown function membrane Tainpak substance Krona-Neng-10 kinds of newly regulated multi-agent excretion gene transfer proteins such as Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Seracchia, Seracchia, and Seracchia are analyzed (Cheng 2003, Lee 2003). 3. The structure of the system-the purchase of the system-is composed of the following components: 4. Determination of the transport activity of Escherichia coli Na^++ by the method of transport. The conditions for the transfer of activity are discussed in detail. The reasons for this are that the amount of SstT produced is insufficient, the cell membrane of Escherichia coli is particularly fragile, and the reasons for this are insufficient. The activity of SstT and E. coli multi-agent excretion was determined by the method of "separation and purification". In the case of SstT and AcrAB, especially in the case of large amounts of occurrence, the amount of occurrence is very high. The activity of the enzyme is determined by the activity of the enzyme, the condition of the enzyme and the result of the enzyme.