パッチクランプ法による細菌細胞のイオントランスポーターの解析

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平成13年度末に東京大学分子細胞生物学研究所より譲り受けたパッチクランプシステムの再構築を行った。機器の老朽化などの理由により、すぐには使用できなかったが、修理を重ねた結果、システムとして稼動することができた。平成13年度に検討を行った宿主大腸菌の巨大化条件を用い、大腸菌Na^+-セリン共輸送系であるSstTの輸送活性をパッチクランプ法により測定した。さまざまな条件検討を重ねたが、現在までのところ、有意な輸送活性を捉えることはできていない。この原因として、SstTの発現量がまだ不足している、用いている大腸菌の細胞膜が特に脆弱である、などの理由が挙げられる。一方では大量発現したSstTの精製方法を確立し、幾つかの性質について調べた(Kim,2002)。上記SstTと共に、大腸菌多剤排出ポンプAcrABの活性をパッチクランプ法によって測定した。SstTで有意な活性が得られていない理由の一つは発現量が少ないことであるが、AcrABの場合、特別な大量発現プラスミドを構築しなくとも十分量のタンパク質が発現している。こちらも活性は捉えられていないが、条件検討を重ねれば活性を捉えることができると考えられる結果を得ている。一方で、いくつかの細菌から新規多剤排出ポンプの遺伝子クローニングを行った。腸内連鎖球菌、セラチア、緑膿菌、セパシアなどから得られたものについてその性質を解析した(Cheng2003,Lee2003)。