MATベクターシステムによる果樹類のマーカーフリー形質転換系の確立

利用MAT载体系统建立果树无标记转化体系

• 批准号: 11876007
• 负责人: 田尾 龍太郎
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11876007/
• 关键词: MATベクター; アグロバクテリウム; 形質転換; 果樹

従来の植物の遺伝子組み換えでは,目的遺伝子の導入確認のために,薬剤耐性遺伝子が用いられている.しかしながら,このマーカー遺伝子が形質転換体に残留するため,一度用いたマーカー遺伝子の再利用が出来ないなど,種々の問題が生じる.このため,後代における分離などでマーカー遺伝子を取り除く方法が考案されてきた.しかしながら,ヘテロ性が高く一世代が長い果樹類では,後代でマーカーを取り除く方法は実用的と言えない.そこで本研究では,我が国の研究者によって開発されたMATベクターシステムと呼ばれる肉眼での形質転換体の選抜とマーカー遺伝子の除去を可能にする新しい遺伝子導入法の果樹類への適用を試みた.当初の研究計画に従って,セイヨウナシ,ニホンナシ,オウトウ,ウメ,カキ,ブドウ,キーウィフルーツのシュート培養を確立し,シュートの茎部分にipt型MATベクターの導入されたアグロバクテリウム菌EHA105株の接種を行った.また,これらシュート培養の葉から作製したリーフディスクへの感染実験も行った.その結果,ブドウとキーウィフルーツでは,接種部位にクラウンゴールが形成された.これらのクラウンゴールは,カルス培地において継代維持することが可能であった.そこで,これらクラウンゴール由来のカルスからDNAを調製し,PCR法により遺伝子導入の確認を行ったところ,ブドウではMATベクターのT-DNA部位の導入とマーカーの離脱が確認された.いっぽう,キーウィフルーツでは遺伝子導入の確認は出来なかった.他の果樹類5種においては,MATベクターを導入したアグロバクテリウムの感染を行っても,クラウンゴールや不定芽形成は全く見られなかった.以上の結果より,MATベクターはブドウのマーカーフリー形質転換利用可能であるものと考えられた.しかしながら,他の果樹類への適用のためにはさらなる検討が必要であるものと思われた.

在植物的常规遗传修饰中，耐药性基因已被用来确认靶基因的引入。但是，由于该标记基因仍然存在于转化体中，因此出现了各种问题，例如无法重复使用标记基因。因此，去除标记基因的方法是通过后代分离的。 Therefore, in this study, we have attempted to apply a new gene transfer method to fruit trees, which allows for the selection of transformants with the naked eye and removal of marker genes, called the MAT vector system, developed by researchers in Japan.According to the original research plan, shoot cultures of pears, Japanese pears, stoves, pears, pears, pears, oysters, grapes and kiwifruits, and we have established shoot cultures, and我们已经引入了农杆菌菌株EHA105，该菌株已在芽茎上用IPT型垫子载体引入。还进行了种子。我们还对这些芽培养物的叶子制成的叶子盘进行了感染实验。结果，在接种位点形成的冠状胆囊在葡萄和kiwifruits中形成。这些冠状胆能够维持在愈伤组织培养基中。因此，从源自这些冠状胆的愈伤组织中制备DNA，并通过PCR确认基因转移。在葡萄中，还进行了垫子向量中的T-DNA位点的引入。确认了汽车的撤离。另一方面，kiwifruits无法确认基因转移。在其他五种果树中，即使在用MAT载体感染了农杆菌时，也没有观察到冠状胆囊或无定形的芽形成。基于上述结果，人们认为垫子向量可用于将葡萄转变为无标记。但是，对于其他果树的应用显然是必需的。