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病理診断用in situ遺伝子検査法の開発

病理诊断原位基因检测方法的发展

基本信息

批准号：
11877417
负责人：
上田國寛
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11877417/
关键词：
in situ PCR法肺癌 K-rus点変異 Taqポリメラーゼ Ampdirect βグロブリン遺伝子 PNAプローブ CSA法

项目摘要

in situ PCR法は、PCRを病理組織片に適用し、顕微鏡下に観察する技術である。まずわれわれは、変異特異的プライマーを用いて、癌細胞における点変異の検出を検討した。対象としたのは、肺癌細胞におけるK-ras点変異で、変異特異的プライマーをジコキシゲニンで標識し、増幅したPCR産物をアルカリホスファターゼで標識した抗ジコキシゲニン抗体で検出し、NBTで発色させた。こうした検出法においては一般に、Taqポリメラーゼが内因性物質(ヘモグロビンや陰性多糖類)によって著しく阻害されるため、検出感度に難がある。そこで、次にわれわれは、血液や糞便中の阻害物質の影響を減弱させ、長鎖DNAの反応性を高めることの知られたAmpdirect^<TM>の添加効果を非固相(液相中)で調査した。Ampdirectは専用のバッファーと添加剤からなっており、Mgなどの金属イオンと界面活性剤に工夫がこらしてある。これを血液サンプルに適用し、βグロブリン遺伝子を標的として増幅効果の検討をおこなった。まず、異なった抗凝固剤を用いて採血し、PCR反応液に2倍ごとの希釈系列で全血を加えたところ、従来のPCRバッファーに比較して、Ampdirectバッファーを用いると良好な増幅が得られた。また全血量が少ないほど良好な増幅を示し、血液中に増幅阻害物質が存在することが示された。抗凝固剤の比較では、へパリンがそれ自身阻害作用を持つことが示された。さらに、HBウイルス感染者から得た血清についても、Ampdirect使用による良好な増幅効果を確認した。そこで現在、in situ PCR法の検出感度を高めるために、Ampdirectを添加し、その増幅への効果を検討している。一方、PCR増幅によらない高感度検出法として、PNAプローブにCSA(Catalyzed Signal Amplification)法を組み合わせた検出法の開発を進めている。これらの検出法により、病理領域における遺伝子検査が飛躍的に発展するものと期待される。

In situ PCR is a technique for microscopic examination of tissue sections. There are different types of cancer cells in different ways. For lung cancer cells, K-ras are different, and the PCR products are different. The method of detection is usually used to detect endogenous substances (such as negative polysaccharides), and it is difficult to detect sensitivity. In addition, the effects of harmful substances in blood and feces were investigated in <TM>non-solid phase (liquid phase). Ampdirect is an additive for metals and interfacial active agents. This is the first time I've ever seen a person who's been in a relationship with someone who's been in a relationship with me. The anti-coagulation agent was used in blood collection, PCR reaction solution was used in 2 times, and the PCR reaction solution was used in 2 times. The whole blood was added in 2 times, and the PCR reaction solution was used in 3 times. The total blood volume is small, the amplitude is good, the amplitude is harmful, and the blood is harmful. The comparison of anti-coagulation agents shows that they have no self-harm effect. In addition, HB virus infection can be detected by serum detection, Ampdirect use can be confirmed by good amplification effect. The sensitivity of PCR in situ is high, Ampdirect is high, and the results are high. One method, PCR amplification, high sensitivity detection method, PNA amplification, CSA(Catalyzed Signal Amplification) method are combined to develop detection method. The development of genetic research in the field of pathology is expected.