BN-PAGEを用いた大腸菌膜プロテアーゼ複合体の解析

使用 BN-PAGE 分析大肠杆菌膜蛋白酶复合物

• 批准号: 11878132
• 负责人: 小椋 光
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11878132/
• 关键词: BN-PAGE; タンパク質複合体; 可溶化; 膜タンパク質; 大腸菌; Fプラスミドの分配; プロテアーゼ

膜プロテアーゼFtsHとその調節タンパク質の複合体を、膜に存在する(インタクトな)状態を維持したままで解析することを目的としてBN-PAGEの適用を試みてきた。そのために、(1)膜に存在するFtsH複合体をインタクトなまま可溶化する条件の確立と(2)大腸菌タンパク質の解析におけるBN-PAGE法の確立をめざしてきた。しかし、残念ながらFtsH複合体をインタクトなまま可溶化する有効な条件を確立することはできなかった。可溶化力の異なる界面活性剤を試し、また可溶化力の弱い界面活性剤と強い界面活性剤を組み合わせるなどの条件を検討したが、良好な結果を得ることはできなかった。BN-PAGEが発表されて10年が経つが、大腸菌を始め細菌の膜タンパク質複合体の解析への応用例はこれまで報告されていない。大腸菌の膜タンパク質の可溶化条件が厳しく、このことがBN-PAGEの大腸菌における応用を難しくしている要因であると思われる。新たな界面活性剤の開発などが必要かもしれない。結果として、現時点ではBN-PAGEを大腸菌で確立することはできなかったが、この研究中に温度感受性ftsH変異株の新しい表現型としてミニFプラスミドの分配阻害を見いだした。ミニFプラスミドの分配装置は膜上の特定の位置に形成されるタンパク質複合体と考えられている。分配装置の解析から今後新たな突破口が開ける可能性もあり、その意味においては一定の成果を得ることができた。

The regulation of membrane protein by FtsH was studied. The state of membrane protein was maintained and analyzed. The application of BN-PAGE was studied. (1) Establishment of conditions for solubilization of FtsH complex in the presence of membrane;(2) Establishment of BN-PAGE method for analysis of Escherichia coli. The conditions for dissolution of the FtsH complex are established. The solubility of different interfacial active agents is tested, the solubility of weak interfacial active agents is tested, the solubility of strong interfacial active agents is tested, the solubility of weak interfacial active agents is tested, the solubility of weak interfacial active agents is tested, and the solubility of weak interfacial active agents is tested. BN-PAGE was developed over a period of 10 years for the analysis of membrane protein complexes of Escherichia coli and bacteria. The solubilization conditions of E. coli membrane are different. New interfacial active agents are needed for development. As a result, BN-PAGE has now been established in E. coli. In this study, a new phenotype of temperature-sensitive ftsH mutants and the distribution resistance of F-protein were observed. The distribution device is formed at a specific position on the membrane. The distribution device is analyzed and the possibility of a new breakthrough is opened.

项目成果

Karata,K: "Dissecting the role of a conserved motif (the second region of homology) in the AAA family of ATPases: site-directed mutagenesis of the ATP-dependent protease FtsH."J. Biol. Chem.. 274. 26225-26232 (1999)

Karata,K：“剖析 ATP 酶 AAA 家族中保守基序（第二同源区）的作用：ATP 依赖性蛋白酶 FtsH 的定点诱变。”J.

Inagawa, T., Kato, J., Niki, H., Karata, K., and Ogura, T.: "Defective plasmid partition in ftsH mutants of Escherichia coli."Mol.Gen.Genet.. (in press). (2001)

Inakawa, T.、Kato, J.、Niki, H.、Karata, K. 和 Ogura, T.：“大肠杆菌 ftsH 突变体中的缺陷质粒分区。”Mol.Gen.Genet..（出版中）。

Makino,S.: "Second transmembrane sebment of FtsH plays a role in its proteolytic activity and homo-oligomerization."FEBS Lett.. 460. 554-558 (1999)

Makino,S.：“FtsH 的第二跨膜部分在其蛋白水解活性和同源寡聚化中发挥作用。”FEBS Lett.. 460. 554-558 (1999)