カルシウムが制御する情報伝達分子を単一細胞で可視化するためのプローブ分子の開発

开发探针分子以可视化单细胞中钙调节信号分子

• 批准号: 00J09656
• 负责人: 佐々木 和樹
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J09656/
• 关键词: Akt; PKB; 蛍光可視化プローブ; 蛋白質リン酸化; Bad; eNOS

Akt/PKBはアポトーシス回避や血管保護作用などに関与するセリン・スレオニンキナーゼである.Aktの活性の時間・空間情報を得るための蛍光可視化プローブの開発を行った.Aktによるリン酸化を検出するために,Aktによるリン酸化が構造変化を誘起し,その構造変化をシアン・黄色の蛍光蛋白質(CFP・YFP)間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)により検出するという分子を設計した.Aktの標的基質蛋白質であるBadのAkt基質ドメインと,そのリン酸化したAkt基質ドメインと結合する14-3-3蛋白質をリンカーで結んだ分子のN・C末端にCFP・YFPをそれぞれ連結した蛍光プローブを作製した.このプローブを内在性のAktの基質である内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)やBadと同じ細胞内局在を持たせることにより,目的の基質のリン酸化を選択的かつ高感度に生きた細胞内で測定することが可能である.そのためeNOSと同様の局在をとるようにeNOSのゴルジ局在化ドメインを,またBadはミトコンドリア外膜に局在をとることがわかっているためミトコンドリア外膜局在化ドメインを,それぞれ作製した蛍光プローブに連結させた.ゴルジ体に局在させたプローブは内皮細胞内で17β-エストラジオール(E2)とインスリンに対して応答し,ミトコンドリア外膜に局在したプローブはE2に対して応答したがインスリンに対しては応答しなかった.一方,細胞質に拡散している局在化シグナルをつけていないプローブはE2またはインスリンに対して応答しなかった.これらの結果から活性化したAktは細胞質に拡散しているのではなく,ゴルジ体やミトコンドリアなどの細胞内小器官に局在し,それによって基質蛋白質特異性やリン酸化効率を上げていることがわかった.

Akt/PKB can avoid vascular protection by detecting the time and space information of Akt activity.Akt can induce acidification by detecting the time and space information. The structure of the protein is changed, and the fluorescence resonance between the yellow fluorescent protein (CFP) and the yellow fluorescent protein (YFP) is changed, and the fluorescence resonance shift (FRET) is changed. The 14-3-3 protein chain is linked to the N-terminal CFP and YFP of the binding molecule. The endogenous Akt enzyme (eNOS) and the Bad enzyme are also present in the intracellular system. The eNOS and the eNOS are in the middle of the game, and the Bad ones are in the middle of the game. The 17β-subunit (E2) in the endothelial cells of the cell is the most important factor in the development of the endothelial cells. On the other hand, the cytoplasm is scattered and the bureau is in the process of transformation. As a result, the activation of Akt in the cytoplasm of the cells was reduced, and the intracellular small organs of the cells were isolated, and the matrix protein specificity and acidification efficiency were increased.