DNA上での蛋白質相互作用を促進するHMGによるDNA変形の構造解析

HMG 促进 DNA 上蛋白质相互作用的 DNA 变形结构分析

• 批准号: 12034209
• 负责人: 楯 真一
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12034209/
• 关键词: NMR; HMG-1; 2; HMG-I; マジック角試料回転; 液晶利用NMR

1.HMG2Aの立体構造解析HMG2蛋白質のN末端側HMG-boxであるAドメインの立体構造解析を完了した。サンプルの安定性・溶解性を改善するために徹底的にサンプル溶液の条件を検討した。最終的に0.1M Na_2SO_4の条件で十分な質のNMRデータを得ることができ現在までに定法どおりのNOEと2面角情報に基づいた立体構造解析を終了している。今後は、さらに精密化を進めるために残余双極子効果を利用した精密化を行う予定である。2.HMG2全長のDNAとの相互作用様式の解析HMG2の全長は2つのHMG-boxと1つの短いリンカーよりなっている。NMRによる構造解析を行うには、DNAに対する結合能が低すぎるために安定な複合体を形成しないため、NMRによる解析に耐える複合体サンプル調製は困難であった。そこで本研究では、CDによりDNA変形能の解析を行うことに計画を変更した。CDによる解析の結果、HMG-box単独ではDNAをkinkさせるが2つのHMG-box(AおよびB)がリンカーにより結び付けられた全長HMG2ではCDパターンからHMG2全長と相互作用したDNAは、あたかもヌクレオソーム中のDNAのような変形構造を持つことが明らかとなった。このことから、HMG2全長は明らかにHMG-boxとは異なるDNA構造変形能を有し、HMG2全長構造としてはじめてDNAシャペロンとしての機能を発揮する可能性を示した。3.HMG-I(2/3)とDNA複合体の構造解析HMG-I(2/3)が結合するDNA(PRDII-NRDI)のNMRシグナル帰属を完了した。また、HMG-I(2/3)-DNA複合体中でのDNAシグナルの帰属も完了し、相互作用部位のminor grooveに特異的なシグナル変化が観測されHMG-Iが認識するDNA側の部位を特定することができた。また、安定同位体標識したHMG-I(2/3)を調製し複合体中での蛋白質側のNMRシグナル帰属のためのデータ集積を完了した。DNAとの相互作用によりアミドプロトンの溶媒との交換が促進される関係で一部帰属が困難な部分があり完全シグナル帰属を完了できていない。複合体調製に関しては安定に行える条件を確立したので、さらにサンプル濃度をあげて完全なシグナル帰属を完了することを目指す。4.定量的な残余双極子効果観測手法の確立HMG2Aドメインの構造精密化およびHMG-I(2/3)-DNA複合体構造の精密化を行うために、すでにHMG2Bの精密化で利用した残余双極子効果の利用を計画している。基本的な測定法はすでに確立されているが、特に蛋白質DNA複合体のような複雑な系に適用する場合には液晶分子の共存の有無による微妙な構造変化や化学シフト変化などにより観測される残余双極子効果の定量性を損ねる恐れがある。そこで本年度の研究中ではマジック角試料回転法を溶液試料に適用することで定量性を向上させる方法を確立した。

1. Stereostructural analysis of HMG2A The N-terminal HMG-box of HMG2 protein has been analyzed. The stability and solubility of the solution are improved. The final condition of 0.1M Na_2SO_4 is very qualitative. The method of determination is very simple. The basic structure analysis is very simple. In the future, the precision of the residual dipole will be determined. 2. Analysis of the interaction model of HMG2 DNA and HMG2 DNA. NMR structural analysis, DNA binding, complex formation, NMR structural analysis, complex modulation, etc. Therefore, this research is planned to be revised to analyze the DNA transformation potential of CD. CD analysis results, HMG-box only two pairs of HMG-box(A and B) two pairs of HMG-box(A and B) two pairs of HMG2 two pairs of HMG2 two pairs of CD two pairs of HMG2 two pairs of DNA two pairs of HMG2 two pairs of HMG2 two pairs of DNA two pairs of HMG2 two pairs of HMG2 two pairs of CD two pairs of DNA two pairs of HMG2 two pairs of DNA two pairs of HMG2 two The HMG2 full-length DNA structure is different from the HMG2 full-length DNA structure. The HMG2 full-length DNA structure is different from the HMG2 full-length DNA structure. 3. Structural Analysis of HMG-I(2/3) and DNA Complexes HMG-I (2/3) and DNA(PRDII-NRDI) Complexes HMG-I(2/3)-DNA complex DNA sequence is complete, the interaction site of the minor groove specific DNA sequence is transformed to detect HMG-I recognition DNA side of the site specific. The protein side of HMG-I(2/3) complex was identified by stable isotope identification and NMR analysis. DNA interactions are partially difficult, partially complete, and partially facilitated by solvent exchange. Complex modulation is related to the establishment of stable conditions, such as concentration, and completion of the process. 4. Quantitative determination of residual dipole effect and structural refinement of HMG2A and HMG-I(2/3)-DNA complex. The basic assay was used to establish the presence or absence of blue shift of liquid crystal molecules and to quantify the residual bipolar effect. In this year's study, the method of quantitative analysis was established.

项目成果

T.Yoshida,S.Uchiyama,H.Nakano,H.Kashimori,H.Kijima,T.Ohshima,Y.Saibara,T.Ishino,H.Shimahara,T.Yoshida,K.Yokose,T.Ohkubo,A.Kaji and Y.Kobayashi: "Solution Structure of the Ribosome Recycling Factor from Aquifex aeolicus"Biochemistry,. (in press). (2001)

T.吉田、S.Uchiyama、H.Nakano、H.Kashimori、H.Kijima、T.Ohshima、Y.Saibara、T.Ishino、H.Shimahara、T.Yoshida、K.Yokose、T.Ohkubo、A.

N.Shimba,E.Kariya,S.Tate,H.Kaji,and M.Kainosho: "Structural comparison between wild-type and P25S human cystatin A by NMR spectroscopy. Does thismutation affect the α-helix conformation?,"Journal of structural and functional genomics. 6. 26-42 (2000)

N. Shimba、E. Kariya、S. Tate、H. Kaji 和 M. Kainosho：“通过 NMR 光谱法对野生型和 P25S 人半胱氨酸蛋白酶抑制剂 A 进行结构比较。这种突变是否会影响 α-螺旋构象？”结构和功能基因组学。6. 26-42 (2000)

N.Tjandra,S.Tate,A.Ono,M.Kainosho,and A.Bax: "The NMR structure of a DNA dodecamer in an aqueous dilute liquid crystalline phase"Journal of American Chemical Society. 122. 6190-6200 (2000)

N.Tjandra、S.Tate、A.Ono、M.Kainosho 和 A.Bax：“水性稀液晶相中 DNA 十二聚体的 NMR 结构”美国化学会杂志。

N.Utsunomiya-Tate,K.Kubo,S.Tate,M.Kainosho,E.Katayama,K.Nakajima,and K.Mikoshiba: "Reelin molecules assemble together to form a large protein complex, which is inihibited by the function-blocking CR-50 antibody"Proc.Natl.Acad.Sci.. 97. 9729-9734 (2000)

N.Utsunomiya-Tate、K.Kubo、S.Tate、M.Kainosho、E.Katayama、K.Nakajima 和 K.Mikoshiba：“Reelin 分子组装在一起形成一个大的蛋白质复合物，该复合物受到以下功能的抑制：