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アクチンを介したHIV-1RevによるウイルスmRNA核外輸送の分子機作の解析

HIV-1Rev肌动蛋白介导病毒mRNA核输出的分子机制分析

基本信息

批准号：
12035226
负责人：
木村富紀
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Kansai Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12035226/
关键词：
HIV-1 Rev 核外輸送 gag mRNA CRM1 GTPγS Luciferase

项目摘要

イントロン陽性のHIV-1構造遺伝子mRNAの核外輸送に、Revの核外輸送シグナル依存的なRan-CRM1との複合体形成及び核内Fアクチンが関与する事を報告した。このgag mRNA-Rev-CRM1/Ran輸送複合体のアクチンを介した核外輸送分子機作の検討を目的とし、培養細胞核へのHIV-1レポーターDNAの顕微注入により、転写されたgag mRNAのRev依存性核外輸送が観察可能な系を確立した。本実験系を用いアクチンを介するgag mRNA核外輸送におけるエネルギー必要性の有無を検討する目的で、非加水分解性GTP analogueのGTPγSを注入したところ、gag mRNAの核外輸送抑制が観察された。FISH法を用い輸送抑制されたgag mRNAの核内局在を観察したところ、大部分は核膜孔(NPC)に到らず核質にび漫性に分布した。これらの結果は、GTPγSに対し感受性を示すのはNPC通過の過程ではなく、輸送複合体形成或いは輸送複合体がNPCに到る核質内輸送過程である事を強く示唆する。そこで両者を鑑別する目的で、レポーター発現プラスミドを導入した細胞核抽出液を用い、GTP或いはGTPγS存在下にRevを免疫沈降したところ、GTPの投与量依存性にCRM1と構造遺伝子mRNAの共沈が認められると共に、これらの共沈はGTPγS処理核抽出液において投与量依存性に阻害される事が観察された。以上の結果から、gag mRNAの核外輸送に際し輸送複合体の形成過程にGTPの加水分解を必要とするか或いはGTPγSが阻害する反応過程が存在し、この過程の阻害によりgag mRNA核外輸送抑制が生じる事が考えられた。Revによる細胞輸送因子の認識にRanを介してGTPが必要となる事はこれ迄報告されているが、上記の結果はmRNAとの複合体形成にあたってもGTPが肝要である事を示しており、RevによるmRNA核外輸送にあたってその認識過程にRanの新しい機能或いは他の核内G蛋白の関与の可能性が考えられた。その他、アクチンを介するウイルスmRNA核外輸送機構が、他のRNA分子の輸送に用いられる可能性を検討した。その結果、Revの共発現によりイントロンレスのFire fly luciferase mRNAの核外輸送が阻害される事を見い出し、Rev-gag mRNA複合体輸送の場合と同様、luciferase mRNAの核外輸送にあたってCRM1,GTP結合型Ran及び核内アクチンの関与を示した。これまで、mRNAの輸送にCRM1は機能しないと考えられており、この報告がその関与を認めた初めての例となる。

Extranuclear transport of HIV-1 gene construct mRNA, formation of Ran-CRM1 complex dependent on Rev and association with intracellular F-protein are reported. Objective: To investigate the molecular mechanism of extracellular transport of gag mRNA-Rev-CRM1/Ran transport complex. To establish a possible mechanism of Rev-dependent extracellular transport of gag mRNA-Rev-CRM1/Ran by microinjection of HIV-1 DNA into cultured cell nuclei. The present study aims to investigate the necessity and existence of non-hydrolytic GTP analogue and GTPγS injection for the detection of gag mRNA extracellular transport inhibition mediated by gene transfer. FISH was used to detect the presence of gag mRNA in the nucleus, and most of them were found in the cytoplasm. The result is that GTPγS sensitivity indicates the process of NPC transport, transport complex formation or transport complex formation, and the process of NPC transport. For the purpose of identification, the gene expression pathway was introduced into the cell nuclear extract in the presence of GTP or GTPγS. In addition, the dose-dependent CRM1 gene expression pathway was detected in the presence of GTP or GTP γ S. These results indicate that the inhibition of gag mRNA exonuclear transport by GTPγS is necessary for the formation of the transport complex and that the inhibition of gag mRNA exonuclear transport by GTPγS exists. Rev. 1: The role of GTP in the understanding of Ran gene expression and its possible role in the understanding of GTP gene expression in the development of mRNA complexes. To explore the possibility of using the extra nuclear mRNA delivery mechanism to transport other RNA molecules. The results showed that the expression of Rev mRNA in the extracellular transport of Fire Fly Luciferase mRNA was blocked, and the expression of Rev-gag mRNA complex in the extracellular transport of Luciferase mRNA was blocked by CRM1, GTP-binding Ran, and so on. CRM1 is a function of mRNA delivery and reporting.