未解明一次代謝経路、非メバロン酸経路に関する遺伝子の機能解析

我々は、放線菌Streptomyces sp.CL190株からクローニングしたメバロン酸経路に関与する遺伝子クラスター中の機能未知ORFが、新しいタイプ(type2)のFMN/NADPH依存型isopentenyl diphosphate(IPP)isomeraseをコードしていることを明らかにしていた。type 2 IPP isomeraseは、IPP生合成経路としてメバロン酸経路を利用する真正細菌や古細菌に広く分布している。一方、枯草菌は非メバロン酸経路を利用するにも拘わらず、type 2 IPP isomeraseをコードしていると考えられる機能未知遺伝子ypgAを有している。そこで本研究では、ypgA遺伝子産物の機能、および非メバロン酸経路を利用する枯草菌における役割について検討した。ypgA遺伝子産物とCL190株由来のtype 2 IPP isomeraseのアミノ酸配列を比較したところ、ypgA遺伝子はN末端側が100アミノ酸残基以上欠損していた。そこで、ypgA遺伝子の上流に存在する開始コドンを検索したところ、138アミノ酸残基長いORF(ypgA2)を同定した。このypgA2遺伝子産物は、ypgA遺伝子産物と比べて他のtype2 IPP isomeraseに、より近いアミノ酸長であった。次に、ypgA遺伝子とypgA2遺伝子を大腸菌で大量発現させ、酵素の精製を試みたが、ypgA産物は不溶化し精製酵素を得ることができなかった。一方、可溶酵素として精製したypgA2産物は、CL190株由来の酵素と同等の活性を示した。また、枯草菌のypgA2遺伝子破壊株は、野生株と比較して生育や菌体の形態に変化はなかった。これらの結果から、ypgA遺伝子より138アミノ酸残基長いORFであるypgA2遺伝子が枯草菌のIPP isomeraseであり、枯草菌にとってIPP isomeraseは必須ではないことが確認された。さらには、枯草菌においても、非メバロン酸経路は、生合成中間体である2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate(MECDP)以降で、IPP経路とDMAPP経路に分岐していることが示唆された。

我々は、放線菌Streptomyces sp.CL190株からクローニングしたメバロン酸経路に関与する遺伝子クラスター中の機能未知ORFが、新しいタイプ(type2)のFMN/NADPH依存型isopentenyl diphosphate(IPP)isomeraseをコードしていることを明らかにしていた。type 2 IPP isomeraseは、IPP生合成経路としてメバロン酸経路を利用する真正細菌や古細菌に広く分布している。一方、枯草菌は非メバロン酸経路を利用するにも拘わらず、type 2 IPP isomeraseをコードしていると考えられる機能未知遺伝子ypgAを有している。そこで本研究では、ypgA遺伝子産物の機能、および非メバロン酸経路を利用する枯草菌における役割について検討した。ypgA遺伝子産物とCL190株由来のtype 2 IPP isomeraseのアミノ酸配列を比較したところ、ypgA遺伝子はN末端側が100アミノ酸残基以上欠損していた。そこで、ypgA遺伝子の上流に存在する開始コドンを検索したところ、138アミノ酸残基長いORF(ypgA2)を同定した。このypgA2遺伝子産物は、ypgA遺伝子産物と比べて他のtype2 IPP isomeraseに、より近いアミノ酸長であった。次に、ypgA遺伝子とypgA2遺伝子を大腸菌で大量発現させ、酵素の精製を試みたが、ypgA産物は不溶化し精製酵素を得ることができなかった。一方、可溶酵素として精製したypgA2産物は、CL190株由来の酵素と同等の活性を示した。また、枯草菌のypgA2遺伝子破壊株は、野生株と比較して生育や菌体の形態に変化はなかった。これらの結果から、ypgA遺伝子より138アミノ酸残基長いORFであるypgA2遺伝子が枯草菌のIPP isomeraseであり、枯草菌にとってIPP isomeraseは必須ではないことが確認された。さらには、枯草菌においても、非メバロン酸経路は、生合成中間体である2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate(MECDP)以降で、IPP経路とDMAPP経路に分岐していることが示唆された。