未解明一次代謝経路、非メバロン酸経路に関する遺伝子の機能解析

与未识别的主要代谢途径和非甲羟戊酸途径相关的基因的功能分析

• 批准号: 12206032
• 负责人: 葛山 智久
• 金额: --
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12206032/
• 关键词: isoprenoid; biosynthesis; nonmevalonate pathway; Streptomyces; IPP isomerase; Bacillus subtilis

我々は、放線菌Streptomyces sp.CL190株からクローニングしたメバロン酸経路に関与する遺伝子クラスター中の機能未知ORFが、新しいタイプ(type2)のFMN/NADPH依存型isopentenyl diphosphate(IPP)isomeraseをコードしていることを明らかにしていた。type 2 IPP isomeraseは、IPP生合成経路としてメバロン酸経路を利用する真正細菌や古細菌に広く分布している。一方、枯草菌は非メバロン酸経路を利用するにも拘わらず、type 2 IPP isomeraseをコードしていると考えられる機能未知遺伝子ypgAを有している。そこで本研究では、ypgA遺伝子産物の機能、および非メバロン酸経路を利用する枯草菌における役割について検討した。ypgA遺伝子産物とCL190株由来のtype 2 IPP isomeraseのアミノ酸配列を比較したところ、ypgA遺伝子はN末端側が100アミノ酸残基以上欠損していた。そこで、ypgA遺伝子の上流に存在する開始コドンを検索したところ、138アミノ酸残基長いORF(ypgA2)を同定した。このypgA2遺伝子産物は、ypgA遺伝子産物と比べて他のtype2 IPP isomeraseに、より近いアミノ酸長であった。次に、ypgA遺伝子とypgA2遺伝子を大腸菌で大量発現させ、酵素の精製を試みたが、ypgA産物は不溶化し精製酵素を得ることができなかった。一方、可溶酵素として精製したypgA2産物は、CL190株由来の酵素と同等の活性を示した。また、枯草菌のypgA2遺伝子破壊株は、野生株と比較して生育や菌体の形態に変化はなかった。これらの結果から、ypgA遺伝子より138アミノ酸残基長いORFであるypgA2遺伝子が枯草菌のIPP isomeraseであり、枯草菌にとってIPP isomeraseは必須ではないことが確認された。さらには、枯草菌においても、非メバロン酸経路は、生合成中間体である2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate(MECDP)以降で、IPP経路とDMAPP経路に分岐していることが示唆された。

The FMN/NADPH-dependent isopentyl diphosphate(IPP)isomerase of Streptomyces sp.CL190 strain is a novel, function-unknown ORF in the mutant strain. Type 2 IPP isomerases are distributed in the IPP biosynthesis pathway and the utilization of the IPP biosynthesis pathway by true bacteria and archaea. A side, Bacillus subtilis, non-acid pathway utilization, type 2 IPP isomerase, test, function unknown, ypgA, has In this study, we investigated the function and non-function of ypgA gene products in the production of Bacillus subtilis. ypgA gene product CL190 strain derived from type 2 IPP isomerase with more than 100 amino acid residues on the N-terminal side. The length of ORF(ypgA2) in the upstream of the ypgA gene was determined by the same method as that of ORF(ypgA2). The ypgA 2 gene product is similar to the ypgA gene product. Second, ypgA gene, ypgA2 gene, Escherichia coli, enzyme purification, ypgA product, insoluble enzyme purification A soluble enzyme was purified and the enzyme activity of CL190 strain was shown. The growth and development of Bacillus subtilis ypgA2 strain is different from that of wild strain. The results of this study are as follows: ypgA gene ORF 138 amino acid residue ORF 138 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate(MECDP) was synthesized from Bacillus subtilis and DMAPP.