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ヘパラナーゼ阻害剤探索系の構築と活性化機構の解析

乙酰肝素酶抑制剂搜索系统构建及激活机制分析

基本信息

批准号：
12217159
负责人：
清水史郎
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12217159/
关键词：
ヘパラナーゼ HepG2細胞 WI-38細胞 RT-PCR法

项目摘要

ヘパラナーゼ活性化機構の解析を目的として、ヘパラナーゼmRNAの定量法をRT-PCR法で検討を行った。様々なプライマーの組み合わせを試行した結果,活性型ヘパラナーゼの全ての配列を含む条件で最適化することができた。この方法を用いて、様々なヒト培養細胞におけるヘパラナーゼの発現量を比較した結果,正常肺繊維芽細胞であるWI-38細胞においては発現量が低く、また、ほとんどの培養がん細胞では発現の亢進がみられた。しかし、肝細胞がん由来のHepG2細胞においてはその発現レベルが低く,正常細胞であるWI-38細胞と同程度であった。また、ヘパラナーゼ阻害剤の探索系に用いる酵素を過剰発現細胞から得るために,ヘパラナーゼ過剰発現細胞の樹立を試みた。最初にヒト肺がん細胞のA549細胞から、全長のヘパラナーゼ遺伝子のクローニングを行った。配列を確認後、C末端にMycとHisのタグをつけた哺乳類発現用ベクターにサブクローニングをした。現在、ヘパラナーゼ低発現細胞であるHepG2細胞に遺伝子を導入し,ヘパラナーゼ高発現細胞のクローン化を行っている。

The aim of this study was to analyze the mechanism of protein activation, and to investigate the quantitative method of protein mRNA by RT-PCR. The results of the experiment show that the activity of the enzyme can be optimized by the combination of enzyme and protein. The results showed that the normal lung tissue cells WI-38 cells showed low, high and high levels of protein expression in cultured cells. HepG2 cells are the origin of liver cells and WI-38 cells are the same as normal cells. The discovery of harmful substances is based on the use of enzymes in the development of cells, and the establishment of cells in the development of enzymes. Initially, A549 cells were isolated from the lung, and full-length cells were isolated from the lung. After the alignment is confirmed, the C terminal Myc and His family members are used for mammalian development. Now, HepG2 cells are transformed into low level cells, and high level cells are transformed into high level cells.