マウスホモロガスリコンビナーゼの遺伝子クローニング

小鼠同源重组酶基因克隆

基本信息

批准号：
12877018
负责人：
野阪哲哉
金额：
--
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

当研究の目的はレトロウイルス発現クローニング法を用いて、マウスにおける遺伝子相同組換え(HR)に関与するホモロガスリコンビナーゼ遺伝子そのもの、またはその活性化遺伝子を単離することである。実験は、まず最初に、targeting vectorが導入されたときにHRを生ずるとNeomycin耐性遺伝子が発現するように細工したNIH3T3細胞由来のレポーター細胞株を樹立し、その細胞にHR活性の高い細胞であるES細胞およびニワトリDT40細胞由来のcDNAをレトロウイルスを用いて各々発現させた。次に、targeting vectorを導入し、しかるべきcDNA存在下で相同組替えを起こしたクローンをG418存在下で単離するという流れで行った。結果はNeo耐性クローンは全く得られず、NIH3T3細胞においては一つの遺伝子の補充だけではHRを生ぜしめることはできないことが判明した。現在、基底レベルのHR活性が比較的高いと思われるCHO細胞を用いて同様の実験を検討している。場合によっては予め、変異原処理によりランダムに遺伝子を破壊しておいてHRが起こらなくした細胞株を用いて、レトロウイルスによる発現クローニング法でその表現型をレスキューする遺伝子を単離するというようなアプローチも必要かもしれないと考えている。2000年度は当実験の目的遺伝子であるホモロガスリコンビナーゼは得られなかったが、レトロウイルス発現クローニング法を用いた一連の研究により、血球細胞の分化や増殖に関与する、マウスおよびヒトMgcRacGAP遺伝子を単離し、同遺伝子が細胞質分裂にも重要な役割を担っていることを見出した。

这项研究的目的是使用逆转录病毒表达克隆方法分离出小鼠遗传同源重组（HR）的同源重组基因本身或活化基因。首先，在引入靶向载体时产生HR时，建立了源自NIH3T3细胞的报告细胞系，以表达新霉素的耐药基因，并分别使用逆转录病毒来表达源自HR高活性的ES细胞的cDNA，cDNA衍生自HR的ES细胞，cDNA是具有较高HR的细胞，并且鸡DT40细胞分别表达。接下来，引入了靶向载体，并在G418存在下分离了在适当的cDNA存在下进行同源重组的克隆。结果表明，没有获得新的抗性克隆，并且在NIH3T3细胞中，无法通过单独补充一个基因来产生HR。我们目前正在使用CHO细胞研究类似的实验，这些实验似乎具有相对较高的基础HR活性。在某些情况下，我们认为可能有必要使用诱变治疗将基因随机破坏的细胞系来防止HR发生，并分离使用逆转录病毒表达克隆方法挽救表型的基因。尽管在2000年未获得同源重物组织酶，即该实验中感兴趣的基因，但使用逆转录病毒表达克隆方法进行了一系列研究，是从小鼠和人类MGCRACGAP基因中分离出参与血液细胞分化和增殖的，并发现该基因在巨细胞运动中起重要作用。