ジーンチップを用いたC型肝炎、肝癌特異的遺伝子発現プロファイルによる遺伝子診断

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本研究は、慢性肝炎から肝硬変あるいは肝細胞癌に進展する要因を、遺伝子発現プロファイルの違いから解き明かし、治療や病態進行抑制に役立つ分子を見つけだすことを目的とする。本研究進行中、遺伝子プロファイルの違いを正確に捉えるためには、材料の採取を厳密に行う必要がある、ことが明らかとなった。そこで解析対象の材料を、HE染色組織像をもとに顕微鏡下でマイクロダイセクションにて採取する方法をとることにした。まずmRNA発現解析に利用できるRNAを、どのような薄切処理材料からマイクロダイセクションして抽出すべきか、またT7-based amplificationの利用とその限界について、VEGF mRNAの半定量RT-PCRにて検討した。その結果、1 凍結切片を作製後、エタノール固定/HE染色を行ったものが、最も安定したRNAが抽出できた。染色後、室温にて1日以上保存したものでも、RNAは壊れていなかった。2 凍結切片:染色後:マイクロダイセクション後で、RNAの回収を半定量したところ、5:1:1であった。染色後では、新鮮凍結切片に比べ1/5の回収となるが、染色後は、マイクロダイセクションによるRNAのロスは観察されなかった。3 T7-based amplificationを3ラウンド行うと、amplified RNA(aRNA)は短い鎖長に偏る。4 1000shotsのマイクロダイセクションサンプルから、T7-based amplificationを1ラウンド行うと、解析可能なaRNAが回収できた。5 マイクロダイセクションによる、スライドガラスからの組織回収率が不安定であり、検討が必要である。6 肝細胞癌特異的に発現増強するといわれるgankirinと発現抑制がかかるといわれるLPTSについて、RT-PCRを行った結果、新鮮凍結切片同様、HE染色後のマイクロダイセクションサンプルでも定量解析可能であった。