肝臓分化マーカー遺伝子の転写調節を利用した、新しい未分化肝前駆細胞分離法の確立

建立利用肝分化标记基因转录调控分离未分化肝祖细胞的新方法

• 批准号: 12877193
• 负责人: 廣瀬 哲朗
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877193/
• 关键词: 肝幹細胞; 肝前駆細胞; トランスジェニックマウス; 蛍光励起セルソーター; 肝細胞; 内胚葉; reporter gene; アルブミン

我々は胚性幹細胞内胚葉マーカーのひとつであるアルブミン遺伝子の肝特異的転写調節領域下にgreen fluorescent protein(GFP)を組み込んだレポーター遺伝子を作成し、GFP発現を利用することで発生上肝細胞分化同定およびその分離が早期から可能なシステム構築を目標としている。この遺伝子産物構築は完成し受精卵への注入を行ったが、注入受精卵中のtransgene陽性胎児数の割合が低く、GFPによる細胞毒性の影響を伺わせた。樹立できた系統もmateがかからず、系統維持が現在のところ困難である。これと平行してこれまでに樹立されているGFPトランスジェニックマウス系統のGFP発現をより詳細に分析することから、肝内では内胚葉系細胞にのみ高いGFP発現を有する系統を見出し、そのGFP発現を利用し、蛍光励起セルソーターで細胞を精製することで、成体や胎仔肝から肝幹細胞を分離できるシステムを作り上げるという当初の目標は達成できた。ただしこの既に樹立されたGFPトランスジェニックマウス系統に内胚葉細胞にもGFP発現を有するものがあるという結果や、それを用いた肝幹細胞分離が可能であるという結果から、やはりGFP毒性の危険は排除されず、発生率や樹立の可能性は通常のトランスジェニックマウスより低いことが予想されものの、ひとたびアルブミンGFPトランスジェニックマウスのような内胚葉マーカー遺伝子を用いたトランスジェニックマウスが樹立されれば、肝幹細胞や肝発生研究に貢献度は高いと考え、現在アルブミンGFP遺伝子の受精卵への注入を再開するとともにより毒性の少ない改良型アルブミンレポーター遺伝子を作成しており、その注入によるトランスジェニックマウス樹立を目標としている。

I 々 は embryonic stem cells in embryo leaf マ ー カ ー の ひ と つ で あ る ア ル ブ ミ ン heritage 伝 son の liver specific planning, regulating field under に green fluorescent Protein (GFP) を group み 込 ん だ レ ポ ー タ ー heritage 伝 を し consummate, GFP 発 を now use す る こ と で 発 born on liver cell differentiation with fixed お よ び そ の separation が early か ら may な シ ス テ ム build を target と し て い る. こ の heritage 伝 zi chan content to construct は complete し fertilized egg へ の injection line を っ た が, injection in the fertilized egg の transgene positive tire where several の cut low が く, GFP に よ る cytotoxicity の influence を bar わ せ た. Establish で き た system も mate が か か ら ず, system maintain が now の と こ ろ difficult で あ る. こ れ と parallel し て こ れ ま で に set さ れ て い る GFP ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス system の GFP 発 now を よ り に detailed analysis す る こ と か ら, intrahepatic で は germ layer within the cell に の み high い GFP 発 を now have す る system を see し, そ の GFP 発 を now use し, 蛍 light excitation セ ル ソ ー タ ー で cells を refined す る こ と で, adult や tire seed liver か ら liver stem cells separation を で き る シ ス テ ム を made げ り る と い う の original target は reached で き た. た だ し こ の に already set さ れ た GFP ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス germ layer cells within the system に に も GFP 発 を now have す る も の が あ る と い う results や, そ れ を with い た liver stem cells separation が may で あ る と い う results か ら, や は り GFP toxicity の dangerous 険 は exclude さ れ ず possibility, や 発 birth rate set の は usually の ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス よ り low い こ と が to think さ れ も の の, ひ と た び ア ル ブ ミ ン GFP ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス の よ う な germ layer in マ ー カ ー posthumous son 伝 を with い た ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス が set さ れ れ ば に や 発 raw liver, liver stem cells research contribution は high い と え test, now ア ル ブ ミ ン GFP 伝 son の Open another す fertilized egg へ の injection を る と と も に よ り less toxic の な い altered ア ル ブ ミ ン レ ポ ー タ ー heritage 伝 son を made し て お り, そ の injection に よ る ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス を aim と し て い る.

项目成果

廣瀬 哲朗, 山岡 義生et al.: "肝細胞・クーロン研究プロトコール"ヒト胎児肝細胞の分離と増殖. 6 (2001)

Tetsuro Hirose、Yoshio Yamaoka 等人：“肝细胞/库仑研究方案”人类胎儿肝细胞的分离和增殖 6 (2001)。

Yasuchika K., Hirose T.et al.: "Establishment of a Highly Efficient Gene transfer System For Mouse Fetal Hepatic Progenitor Cells"Hepatology. (in press).

Yasuchika K.、Hirose T.等人：“小鼠胎儿肝祖细胞高效基因转移系统的建立”肝病学。

Azuma H., Hirose T.et al.: "Enrichment of Alpha-Fetoprotein Positive Immature Endodermal Cells from Adult Mouse Liver"American Journal of Pathology. (in press).

Azuma H.、Hirose T.等人：“来自成年小鼠肝脏的甲胎蛋白阳性未成熟内胚层细胞的富集”美国病理学杂志。

廣瀬哲朗, 中辻憲夫: "ES細胞のtissue engineeringへの応用"細胞. 32. 338-342 (2000)

Tetsuro Hirose、Norio Nakatsuji：“ES 细胞在组织工程中的应用”Cell 32. 338-342 (2000)。

Oe S., Hirose T.et al.: "Continuous Intravenous Infusion of Deleted Form of Hepatocyte Growth Factor Attenuates lachemia-Reperfusion Injury"J. Hepatology. 34. 832-839 (2001)

Oe S.、Hirose T.et al.：“连续静脉输注删除形式的肝细胞生长因子可减轻贫血再灌注损伤”J。