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単一細胞の顕微解析による細胞質遺伝機構の分子形態学的研究

通过单细胞显微镜分析细胞质遗传机制的分子形态学研究

基本信息

批准号：
01J05096
负责人：
西村芳樹
金额：
$ 1.73万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J05096/
关键词：
母性遺伝葉緑体DNA DNase Native-PAGE

项目摘要

細胞内小器官であるミトコンドリアや葉緑体は、各々細胞核とは異なる独自のDNAを保持しており、それらはヒトを含む多くの動植物において母性遺伝する。従来、この現象は雌雄の配偶子の大きさの違いに基づき、確率論的に説明されてきた。しかし全く同型の配偶子により生殖を行う単細胞緑藻クラミドモナス(Chlamydomonas reinhardtii)においても葉緑体の母性遺伝が観察されたことから(Sager,1954)、より積極的な母性遺伝制御機構の存在が示唆されてきた。1999年、我々はこのクラミドモナスを用い、雄葉緑体DNAが接合後90分以内に積極的かつ完全に分解されることを示した(Nishimura et al.,1999 PNAS)。そして今回、さらに雄葉緑体DNAの分解に関わる酵素の解析を行った。我々はまず、接合子より無傷葉緑体を新規に開発したエアーブラシ法によって単離し、その中に含まれるDNA分解酵素活性の変化を、接合後の時間を追って観察した。DNA分解酵素の検出には、非変性条件で酵素活性を分析できるNative-PAGE in gel assay法を採用した。その結果、接合後90分後までに活性がピークに達する分子量140kDaの新規DNA分解酵素活性が検出された。さらに、葉緑体内のデンプン蓄積量が違う雌雄の配偶子を接合させることにより、接合子から雌雄の葉緑体をそれぞれ密度勾配遠心法で選択的に取り出す方法を開発した。この方法を用いて雌雄の葉緑体におけるDNA分解酵素活性の変化を比較したところ、DNA分解酵素活性の上昇は、父方の葉緑体でのみ起きることが明らかとなった。今回発見されたDNA分解酵素活性の上昇のタイミング、及び局在は、雄葉緑体DNAの分解と正確に一致するものであり、これが母性遺伝に関与する可能性が強く示唆されることとなった。次に、我々は様々な生活環の細胞におけるDNA分解酵素活性の比較を行った。その結果、このDNA分解酵素活性は、配偶子誘導とともに雌の細胞でのみ誘導されることが明らかになった。以上の結果より、我々は今回発見された新規DNA分解酵素を雌配偶子特異的DNase (Mating type minus gamete specific DNase : MDN)と命名し、このMDNに基づく新しい母性遺伝機構のモデルを提唱した(Nishimura et al.,2002 Genes ＆ Dev.)。

The small organs in the cell are called chloroplasts, and the nuclei of each cell are different from each other. The DNA of each cell is maintained independently, and the DNA of each cell contains many maternal genes of animals and plants. This phenomenon is explained by the fact that the male and female couples are in violation of the basic law and the accuracy theory. All isotypes of mating cells are reproductive cells (Chlamydomonas reinhardtii), chloroplast maternal genes are detected (Sager, 1954), and active maternal genetic control mechanisms are present. In 1999, the male chloroplast DNA was positively decomposed within 90 minutes after conjugation (Nishimura et al., 1999 PNAS)。The analysis of enzymes involved in the breakdown of male chloroplast DNA in the present day and today The enzyme activity of DNA in the cytoplasm and the time after conjugation were observed. DNA degradation enzyme activity analysis under different conditions was performed using Native-PAGE in gel assay. As a result, the activity of a new DNA decomposing enzyme with a molecular weight of 140 kDa was detected 90 minutes after conjugation. In addition, the amount of chloroplast accumulation in the chloroplast is not consistent with the amount of chloroplast accumulation in the male and female zygotes, so that the density of the chloroplast in the male and female zygotes outside the zygote can be matched with the remote method. This method is used to compare the changes in DNA enzyme activity between male and female chloroplasts. Now we can see that the increase of DNA decomposing enzyme activity in male and female chloroplasts is very likely to be related to the correct decomposition of DNA in male and female chloroplasts. Comparison of DNA-decomposing enzyme activities in cells of the secondary and reverse life cycle The result is that the activity of DNA decomposing enzyme is induced by the partner and induced by the female cell. As a result of the above, I have recently discovered a new rule for the DNA-decomposing enzyme female-specific DNase (Mating type minus gamete specific DNase: MDN) and named it "the new mother's heritage institution"(Nishimura et al., 2002 Genes & Dev.)。