Exploration of chloroplast DNA repair mechanism with the cancer therapy

葉緑体DNAは、光合成電子複合体の近傍に位置するため、常に活性酸素種などの遺伝毒性物質に曝露される。そのため迅速なDNA修復が不可欠なはずであるが、その分子機構の詳細は十分に理解されていない。研究の障害となってきたのは、植物細胞には３つの異なるゲノム（細胞核、ミトコンドリア、葉緑体）が混在する点である。本研究では、このなかで葉緑体ゲノムだけに二本鎖切断(Double strand break: DSB)を引き起こす手法の開発に取り組み、細胞の応答を解析することで、葉緑体DNA修復機構の時空間的理解を目指した。本研究で用いたのは、1980年代に動物細胞で用いられたUVA照射によるDSB誘導法である。BrdU標識したDNAをHoechst染色すると、通常は無害であるはずのUVA(365 nm)照射によって二本鎖切断が引き起こされる。本研究では単細胞緑藻クラミドモナスをモデルとして、FuUrd存在下で葉緑体DNAのみをBrdU標識することで、生きた細胞に対しUVA照射をすることで葉緑体DNA特異的なDSBを導入する方法の開発に取り組んだ(BrdU/UVA/hoechst-mediated pt/cpDNA scission: BUMPS法）。DSB検出法として用いたのは、アポトーシスにおけるDSB検出法としてしられるTUNEL法である。この手法により様々な処理条件でのDSBを解析したところ、UVC(254 nm)照射では蛍光顕微鏡下で細胞核と葉緑体核様体の両方にDSBが観察されたのに対し、BrdU/FrUrd/Hoechst処理細胞では葉緑体核様体のみDSBが検出された。さらにUVA照射５分後の葉緑体核様体では明瞭に観察されたDSBが、30分後には検出されなくなったことから、葉緑体DNA修復に要する時間が世界で初めて明らかになってきた。

葉緑体DNAは、光合成電子複合体の近傍に位置するため、常に活性酸素種などの遺伝毒性物質に曝露される。そのため迅速なDNA修復が不可欠なはずであるが、その分子機構の詳細は十分に理解されていない。研究の障害となってきたのは、植物細胞には３つの異なるゲノム（細胞核、ミトコンドリア、葉緑体）が混在する点である。本研究では、このなかで葉緑体ゲノムだけに二本鎖切断(Double strand break: DSB)を引き起こす手法の開発に取り組み、細胞の応答を解析することで、葉緑体DNA修復機構の時空間的理解を目指した。本研究で用いたのは、1980年代に動物細胞で用いられたUVA照射によるDSB誘導法である。BrdU標識したDNAをHoechst染色すると、通常は無害であるはずのUVA(365 nm)照射によって二本鎖切断が引き起こされる。本研究では単細胞緑藻クラミドモナスをモデルとして、FuUrd存在下で葉緑体DNAのみをBrdU標識することで、生きた細胞に対しUVA照射をすることで葉緑体DNA特異的なDSBを導入する方法の開発に取り組んだ(BrdU/UVA/hoechst-mediated pt/cpDNA scission: BUMPS法）。DSB検出法として用いたのは、アポトーシスにおけるDSB検出法としてしられるTUNEL法である。この手法により様々な処理条件でのDSBを解析したところ、UVC(254 nm)照射では蛍光顕微鏡下で細胞核と葉緑体核様体の両方にDSBが観察されたのに対し、BrdU/FrUrd/Hoechst処理細胞では葉緑体核様体のみDSBが検出された。さらにUVA照射５分後の葉緑体核様体では明瞭に観察されたDSBが、30分後には検出されなくなったことから、葉緑体DNA修復に要する時間が世界で初めて明らかになってきた。