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テロメア結合タンパク質によるシロイヌナズナの葉の老化誘導機構の構造科学的解析

端粒结合蛋白诱导拟南芥叶片衰老机制的结构科学分析

基本信息

批准号：
13014215
负责人：
森田勇人
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

シロイヌナズナのAtTRPは、第5染色体上に1コピーだけ存在するテロメア結合タンパク質で、Myb様のDNA結合モチーフを持ち、植物に存在するいくつかのイニシエーター結合タンパク質との類似性を持つ。AtTRPのMyb様領域はタンパク質全体のC末端側の領域に存在し、ゲルシフト実験の結果より、Myb様領域単独(55アミノ酸残基)ではテロメアリピートに対する結合親和性が低く、Myb領域の後ろのC末側領域(58アミノ酸残基)が存在して初めてテロメアリピートに対する選択的結合親和性が確認された。本研究では、部分的に欠損したC末領域を持つMyb様領域の作製を行い、ゲルシフト実験ならびに多次元NMR分光法による立体構造解析を行うことで、Myb様領域に続くC末側の領域がテロメア領域認識において果たす機能を解明することを目的とした。AtTRPのMyb様領域と完全長のC末領域を含むタンパク質は、大腸菌による大量発現系で可溶性画分として作製できたが、部分的に欠損したC末領域を持つMyb様領域は殆どが不溶性画分として回収され、変性剤による再生効率も低かった。そこで、タンパク質のフォールディングのタイミングが大腸菌と異なるコムギ胚芽の抽出物を用いた無細胞合成系を使用して大量発現を試みた。その結果、Myb様領域と完全長もしくは欠損したC末領域を持つタンパク質の殆ど全てを可溶性画分して回収することに成功した。さらに、この無細胞合成系では、約300μlの反応系で15nmol以上蛋白質が合成され、発現されたタンパク質にのみ特異的にラベルアミノ酸の取り込みが行われた。従って、全く精製を行わない試料溶液を用いて、発現したタンパク質の^1H-^<15>N HSQCスペクトルを測定することに成功した。現在、ゲルシフト実験を行うことでテロメアリピートの選択的認識に必須のC末領域の特定、ならびに^<15>N、^<13>Cの選択的二重標識体を作製し完全長のC末領域を持つMyb様領域の溶液構造解析を進めている。

AtTRP of chromosome 5 is similar to that of chromosome 1, Myb, and plants. The Myb domain of AtTRP has a low binding affinity for all C-terminal domains of the domain, and the Myb domain alone (55 amino acid residues) has a low binding affinity for all C-terminal domains of the domain. The Myb domain has a low binding affinity for all C-terminal domains of the domain, and the Myb domain alone (58 amino acid residues) has a low binding affinity for all C-terminal domains of the domain. In this study, some of the deficiencies in the domain of C are related to the operation of Myb domain, the analysis of stereo structure by multiple element NMR spectroscopy, and the function of Myb domain. AtTRP Myb domain is completely long, C-terminal domain is contained in a large amount of soluble compounds, coliform is contained in a large amount of soluble compounds, and some of the soluble compounds are deficient in C-terminal domain. Myb domain is almost insoluble in soluble compounds, and the regeneration efficiency is low. A cell-free synthetic system for the production of E. coli and E. coli embryos was developed. As a result, Myb domain is completely undamaged, C domain is completely soluble, and C domain is successfully recovered. In addition, about 300μl of this cell-free synthesis system was used to synthesize more than 15nmol of protein. The sample solution was purified and the quality of the sample was determined<15>. Now, we need to study the solution structure analysis of the C-end domain in order to understand the choice of the C-end <15><13>domain.