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Nkx2.5を軸とした心臓の発生機構の系統的解析

以Nkx2.5为中心系统分析心脏发育机制

基本信息

批准号：
13045019
负责人：
田中誠
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13045019/
关键词：
発生・分化循環器・高血圧遺伝子再生医学先天性心疾患

项目摘要

本研究は胎生初期から心臓で特異的に発現するホメオボックス遺伝子であるNkx2.5を軸に心臓の発生を制御する分子カスケードを系統的に解析することを目的としている。本研究の第一の目的は、Nkx2.5の発現を制御する上流遺伝子を同定することにより、マウスにおける心筋系列(cardiac lineage)の決定機構を明らかにすることである。Nkx2.5周辺のゲノムDNAを含むBACクローンを複数クローニングし、上流40kbまでカバーする5種類のレポーターコンストラクトを作製した。現在、ES由来心筋細胞を用いてのレポーターアッセイが進行中であり、さらにエンハンサーを絞り込んでいく予定である。本研究の第二の目的は、Nkx2.5の下流遺伝子群を同定することにより、心臓の初期形成やルーピングに重要な遺伝子群をクローニングすることである。8.5日胚の心臓より採取したRNAをT7またはPCRを用いて増幅し、それぞれDNAチップ、サブトラクションに用いた。得られた遺伝子については、野生型とホモの心臓での発現の差をin situ hybridizationにて確認した。今までに、ホモの心臓で発現がない遺伝子、ホモの心臓で発現が異常に増加している遺伝子を数種ずつ単離しており、現在発現パターンや機能について解析中である。Nkx2.5は、胎生中期以降の心房中隔の形成や心房内・房室間での刺激の伝導にも重要な役割を果たすが、心房のみでNkx2.5をノックアウトしたマウスを作製し、それらのメカニズムを調べることが本研究の第三の目的である。ミオシン軽鎖2Vの遺伝子座にNkx2.5をノックインするためのコンストラクトを作製し、ES細胞にトランスフェクションした。相同組みかえ体を単離し、さらにCre発現ベクターにより、Neoカセットを取り除いた相同組みかえクローンを得た。胚盤胞への注入が終了し、現在キメラマウスの誕生を待っているところである。

In this study, the purpose of this study is to analyze the molecular biology system of Nkx2.5 in the early stage of fetal life. In this study, the first objective, Nkx2.5 system, is to make sure that the system is the same as that of the system, and the system (cardiac lineage) determines that the organization is responsible for the system. The DNA of Nkx2.5 contains the number of copies of the BAC file, the number of copies, the number of copies. At present, the reason why ES is in the process of causing serious problems is that it is necessary to determine whether or not to make a decision. In this study, the second purpose, the lower subgroup of Nkx2.5, and the early formation of the subgroup of heart disease were identified, and the heart was formed in the early stage. 8.5-day embryos were picked up in RNA