細胞内発現抗体を用いたCAGリピート病の発症解明と遺伝子治療への応用

使用细胞内抗体阐明 CAG 重复疾病的发病及其在基因治疗中的应用

基本信息

批准号：
13210131
负责人：
石黒啓司
金额：
$ 3.71万
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

CAGリピート病は神経変性疾患に特有の遺伝子変異であり、その翻訳された産物には伸長ポリグルタミン鎖が共通の細胞内異常蛋白質として存在する・ハンチントン病モデルマウスを解析した結果、脳の領域特異的かつ週齢依存的に神経細胞の核内に凝集体が形成され、神経病理学的異常として観察を行ってきた。この異常な状態を解消する方法の一つとして細胞内発現抗体(イントラボディー)を用いた試みがなされている。本研究では、ハンチントン病の原因遺伝子転写翻訳産物であるハンチンチン蛋白質に対する抗体を取得することを目的としている。この抗体を細胞内で抗原抗体反応ができるように1本鎖として作らせるために、人工抗体ライブラリー(ラクダ抗体ライブラリー)から取得した。用いた抗原(ハンチンチン)は、神経変性疾患で観察されるアポトーシス関連蛋白分解酵素であるカスパーゼ1及び3の切断領域とハンチンチンN末端のリンコンビナント蛋白質の2種類を精製した。カスパーゼ切断部位領域に対する抗体遺伝子を検討したところ、7種類の1本鎖抗体遺伝子を得た。これらの抗体は、抗原結合活性に強弱があり、5種類の抗体は比較的強い反応性を示した。一方、ハンチンチンN末端は疎水性アミノ酸が多く、抗原は発現後大腸菌の不溶性画分に移行する。高濃度尿素存在下でインテイン結合蛋白質として溶出し、精製を行った。これらの抗原を用いて、ハンチンチンN末端(18アミノ酸)を抗原としてヒトFv抗体ライブラリーからの抗体遺伝子単離を開始した。

CAG重复疾病是神经退行性疾病独有的遗传突变，翻译后的产物包含伸长的聚谷氨酰胺链作为常见的细胞内异常蛋白。由于分析了亨廷顿氏病模型，在大脑中以特异性和年龄依赖性方式在神经元核中形成的聚集体，并将观察结果视为神经病理学异常。解决了这种异常状态的一种方法已尝试使用细胞内表达的抗体（内部象征）。这项研究旨在获得针对亨廷顿蛋白的抗体，亨廷顿蛋白是亨廷顿氏病基因致病基因的转录翻译产物。该抗体是从人工抗体库（骆驼抗体库）中获得的，以使其成为单个链，以便它可以在细胞内进行抗原抗体反应。纯化了两种类型的抗原（Huntingtin）：胱天蛋白酶1和3的裂解区域，在神经退行性疾病中观察到与凋亡相关的蛋白水解酶，以及在匈奴植物N-末端的磷组合蛋白。当检查了胱天蛋白酶切割位点区域的抗体基因时，获得了七种类型的单链抗体基因。这些抗体具有较强的抗原结合活性，五种类型的抗体表现出相对较强的反应性。另一方面，亨廷顿n-末端是大量疏水氨基酸，并且在表达后将抗原转移到大肠杆菌的不溶部分中。在高浓度的尿素存在下，将混合物洗脱为内加结合蛋白并纯化。这些抗原用于使用Huntingtin N-末端（18个氨基酸）作为抗原来从人FV抗体文库中分离抗体基因。