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細胞内発現抗体を用いたCAGリピート病の発症解明と遺伝子治療への応用

使用细胞内抗体阐明 CAG 重复疾病的发病及其在基因治疗中的应用

基本信息

批准号：
12210139
负责人：
石黒啓司
金额：
--
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12210139/
关键词：
ハンチントン病 CAGリピート細胞内発現抗体モデルマウス線状体

项目摘要

ハンチントン病(HD)はHD遺伝子のエクソン1の存在するCAGリピートの異常伸長が原因と考えられる神経変性疾患である。本研究は、この遺伝子産物の機能と構造の解明、及び遺伝子治療に向けたツールの作製を目的としている。はじめに、28、42、77及び107CAGリピートを持つヒトHD遺伝子エクソン1を各種発現ベクターに導入した。この発現遺伝子を大腸菌内に挿入して蛋白質の産生を試みたが、大腸菌自身の増殖が極めて悪かった。28CAGリピートを持つエクソン1に関してはわずかに蛋白質の産生を確認した。また、エクソン2-8とエクソン12-13を同様の発現系にて蛋白質の精製を試みた。その結果、エクソン12-13に関して大腸菌体に蛋白質を分泌していることが発現誘導剤(IPTG)の処理から判明した。この蛋白質はインテリンーキチン結合蛋白質との融合蛋白質であり、カラム中にて還元剤と静置することで目的の蛋白質を切断、精製することができた。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、ほぼ95%以上の精製蛋白質と確認した。この領域は4ヶ所のカスパーゼ3切断部位が存在しており、HDの神経変性に関与した核内凝集体の形成に必須の蛋白質部位と考えられている。このリコンビナント蛋白質を用いてファージ抗体ライブラリーから抗体の精製を行っている。また、この蛋白質部分を用いてマウスとウサギに免疫を開始した。マウスは免疫後、脾臓を摘出して抗体遺伝子用cDNAライブラリーを作製し、ファージ抗体ライブラリーとして使用する。また、ウサギから免疫血清を作製してカスパーゼ3切断部位の構造解析及びカスパーゼ機能阻害活性の標準抗体とする。

The cause of abnormal elongation of CAG in HD is examined in detail. The purpose of this study is to clarify the function and structure of gene products, and to study the mechanism of gene therapy. CAG, 28, 42, 77, and 107 are available in HD. The development of these proteins in E. coli and the growth of E. coli itself 28 CAG is the first to confirm protein production. 2 - 8 and 12 - 13 are the same as the development system, and the purification of protein is tried. The results showed that IPTG treatment was necessary for protein secretion in Escherichia coli. The protein is cut off and purified from the fusion protein. SDS-Polaroid Electrophoresis Results: More than 95% of purified protein was confirmed. This domain is related to the formation of nuclear aggregates and protein sites necessary for the formation of nuclear aggregates. The purification of antibodies is carried out in the process of protein purification. The protein part of the body is called "the first part". After immunization, the antibody gene was extracted and used for cDNA synthesis. The structure analysis of the cut site and the standard antibody of the function inhibition activity of the cut site are described in detail.