細胞内発現抗体を用いたCAGリピート病の発症解明と遺伝子治療への応用

使用细胞内抗体阐明 CAG 重复疾病的发病及其在基因治疗中的应用

基本信息

批准号：
12210139
负责人：
石黒啓司
金额：
--
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12210139/
关键词：
ハンチントン病 CAGリピート細胞内発現抗体モデルマウス線状体

项目摘要

ハンチントン病(HD)はHD遺伝子のエクソン1の存在するCAGリピートの異常伸長が原因と考えられる神経変性疾患である。本研究は、この遺伝子産物の機能と構造の解明、及び遺伝子治療に向けたツールの作製を目的としている。はじめに、28、42、77及び107CAGリピートを持つヒトHD遺伝子エクソン1を各種発現ベクターに導入した。この発現遺伝子を大腸菌内に挿入して蛋白質の産生を試みたが、大腸菌自身の増殖が極めて悪かった。28CAGリピートを持つエクソン1に関してはわずかに蛋白質の産生を確認した。また、エクソン2-8とエクソン12-13を同様の発現系にて蛋白質の精製を試みた。その結果、エクソン12-13に関して大腸菌体に蛋白質を分泌していることが発現誘導剤(IPTG)の処理から判明した。この蛋白質はインテリンーキチン結合蛋白質との融合蛋白質であり、カラム中にて還元剤と静置することで目的の蛋白質を切断、精製することができた。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、ほぼ95%以上の精製蛋白質と確認した。この領域は4ヶ所のカスパーゼ3切断部位が存在しており、HDの神経変性に関与した核内凝集体の形成に必須の蛋白質部位と考えられている。このリコンビナント蛋白質を用いてファージ抗体ライブラリーから抗体の精製を行っている。また、この蛋白質部分を用いてマウスとウサギに免疫を開始した。マウスは免疫後、脾臓を摘出して抗体遺伝子用cDNAライブラリーを作製し、ファージ抗体ライブラリーとして使用する。また、ウサギから免疫血清を作製してカスパーゼ3切断部位の構造解析及びカスパーゼ機能阻害活性の標準抗体とする。

亨廷顿氏病（HD）是一种神经退行性疾病，被认为是由于HD基因外显子1在存在的情况下CAG重复伸长引起的。这项研究旨在阐明该基因产物的功能和结构，并为基因治疗创造工具。首先，将28、42、77和107 CAG重复的人类HD基因外显子1引入各种表达矢量中。该表达的基因被插入大肠杆菌以尝试产生蛋白质，但大肠杆菌本身的增殖非常差。 EXON 1确认了轻微的蛋白质产生，该外显子具有28 CAG重复序列。此外，使用与外显子2-8和12-13的同一表达系统尝试蛋白质纯化。结果，用表达诱导剂（IPTG）的治疗表明，外显子12-13将蛋白质分泌到大肠杆菌细胞中。该蛋白是一种融合蛋白，具有静脉蛋白结合蛋白，通过在色谱柱中与还原剂站立，靶蛋白可以被切割和纯化。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果证实，该蛋白质约为95％或更纯化。该区域包含四个caspase 3裂解位点，被认为是形成参与HD神经变性的核聚集体的必不可少的蛋白质位点。使用该重组蛋白从噬菌体抗体文库中纯化抗体。此外，该蛋白质部分用于对小鼠和兔子产生免疫力。免疫后，将脾切除以生成用于抗体基因的cDNA文库，该基因用作噬菌体抗体库。此外，从兔子制备免疫血清，形成一种标准抗体，该抗体分析了caspase 3裂解位点的结构并抑制caspase功能。