EBウイルスの上皮細胞トロピズムを決定する新規レセプター遺伝子のクローニング

决定 EBV 上皮细胞趋向性的新型受体基因的克隆

• 批准号: 13226001
• 负责人: 吉山 裕規
• 金额: --
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13226001/
• 关键词: EBウイルス; 上皮細胞; トロピズム; レセプター; クローニング

20種類の細胞で、EBV感受性と高感度RT-PCRによるCD21発現を調査した。その結果、ヒト胃上皮由来のAGS細胞がもっとも高いEBV感染効率を示し、CD21を発現していなかった。そこで、AGS細胞のmRNAからcDNAを作製し、マウスレトロウイルス由来のpLIBベクターにクローニングして、発現cDNAライブラリーを作製した。cDNAクローンを導入発現させる標的細胞として、元来はEBV感染に抵抗性であるが、CD21を発現させることで、EBV感染に高度に感受性となる細胞を探索した。CD21分子を各種動物由来の細胞に導入する実験を行ない、イヌのMDCK細胞がCD21導入によりEBV感受性になり、感染効率も優れていたため、MDCK細胞にcDNAクローンを導入発現させることでExpression cloningを開始した。作製した10^7クローンサイズのcDNAライブラリーを10^4クローンのプールに分けてレトロウイルスを作製し、pLIB1〜100とナンバリングした。それぞれのプールのレトロウイルスをMDCK細胞に感染させ、さらにネオマイシン抵抗性遺伝子とGFP遺伝子を組み込んだ組換えEBVを感染させた後、G418による選択を行った。また、CD21を組み込んだpLIBも作製し、陽性コントロールとした。ネオマイシン耐性のMDCK細胞のコロニー数は、CD21導入細胞では200〜800個で、cDNAライブラリーを導入した場合は0〜8個のMDCK細胞コロニーが出現した。また、遺伝子を導入していない陰性コントロールからも1〜3個のMDCK細胞コロニーが出現、バックグラウンドが認められた。そこで、この段階で耐性MDCK細胞からcDNAを回収することは行わずに、ネオマイシン耐性MDCK細胞のコロニーをたくさん作る4番目の遺伝子プールをさらに解析することにした。4番目の10^4サイズのcDNAプールで形質転換した大腸菌ストックを90分だけ培養し、希釈して、アンピシリンを含むLB培地プレートで1,000個の大腸菌コロニーを形成させ、1,000クローンサイズのcDNAライブラリーのサブプールを10個作製した。このサブプール由来のレトロウイルスをpLIB4-1〜10として、同様な実験を行った。もし、このサブプールのひとつに、EBウイルス高感受性を与えるものがあれば、目的の遺伝子をクローニングするための遺伝子ライブラリーの数を10,000から1,000に減少させることができると考えた。実験の結果、pLIB4-1では耐性MDCK細胞のコロニー数が増加しており、しかもコロニーが近接して観察されたことより、pLIB4-1のプールに目的遺伝子が含まれると考えられた。今後、pLIB4-1を用いて分離した耐性MDCK細胞クローンについて解析を進めていく。

20 types of cells, EBV susceptibility and high-sensitivity RT-PCR were used to investigate the expression of CD21.その results, ヒトGastric epithelium-derived AGS cells, EBV infection efficiency is high, and CD21 is present. The origin of そこで, AGS cell のmRNA からcDNAを production, and マウスレトロウイルスのpLIB ベクターにクローニングして, 発 appear cDNA ライブラリーをproduced した. The introduction of cDNA into the target cells showed resistance to EBV infection and resistance to EBV infection.が, CD21 is present and EBV infection is highly susceptible, and EBV infection is highly susceptible and cells are being explored. The CD21 molecule has been introduced into cells derived from various animals, such as the introduction of CD21 into MDCK cells, and the susceptibility to EBV has been introduced.になり, Infection Efficiency も优れていたため, MDCK Cell にcDNA クローンをImport 発appear させることでExpression Cloning is starting. Made by した10^7クローンサイズのcDNAライブラリーを10^4クローンのプールに分けてレトロウイルスを Manufacturer, pLIB1~100とナンバリングした.それぞれのプールのレトロウイルスをMDCK cell infectionさせ、さらにネオマイシンresistant inheritance After the EBV-infected group was infected with GFP, G418 was selected.また, CD21をgroup み込んだpLIBもproducer, positive コントロールとした. The number of ネオマイシン-resistant MDCK cells and CD21-introduced cells are 200 to 800 When 0 to 8 MDCK cells were introduced into the cDNA program, they appeared.また、缝子を Import していない女コントロールからも 1~3のMDCK cells appear and バックグラウンドが recognizes められた. Resistance to MDCK cells in stages MDCK cell analysis of the 4th edition of MDCK cells. 4th chapter of 10^4サイズのcDNA プールでmorphological transformation of coliform bacteria ストックを90minutesだけcultivationし、西釈して、アンピシリンをcontainsむLBpediプレートで 1,000 coliform bacteria させ、1,000 クローンサイズのcDNAライブラリーのサブプールを10 pieces made.このサブプールのレトロウイルスをpLIB4-1~10として、同様な実験を行った.もし、このサブプールのひとつに、EBウイルス高sensitivityを和えるものがあれば、Purpose の伝子をクローニさせることができるとtestえた.実験のRESULTS, pLIB4-1 では-resistant MDCK cells のコロニーnumber がincreased しており, しかもコロニーがNearly して観茶されたことより, pLIB4-1のプールに目缝子が灾れると卡えられた. From now on, pLIB4-1 will be separated and analyzed in resistant MDCK cells using the same method.

项目成果

Aozasa, K.: "EBV and malignant lymphoma with special emphasis on pyothorax-associated lymphoma"Current Topics in Microbiology and Immunology. 258. 103-120 (2001)

Aozasa, K.：“EBV 和恶性淋巴瘤，特别强调脓胸相关淋巴瘤”微生物学和免疫学当前主题。

Igarashi M: "Ammonia as an accelerator of tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis of gastric epithelial cells in Helicobacter pylori infection"Infection and Immunity. 69(2). 816-821 (2001)

Igarashi M：“氨作为幽门螺杆菌感染中肿瘤坏死因子α诱导的胃上皮细胞凋亡的加速剂”感染与免疫。