EBウイルスの上皮細胞トロピズムを決定する新規レセプター遺伝子のクローニング

决定 EBV 上皮细胞趋向性的新型受体基因的克隆

• 批准号: 13226001
• 负责人: 吉山 裕規
• 金额: --
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13226001/
• 关键词: EBウイルス; 上皮細胞; トロピズム; レセプター; クローニング

20種類の細胞で、EBV感受性と高感度RT-PCRによるCD21発現を調査した。その結果、ヒト胃上皮由来のAGS細胞がもっとも高いEBV感染効率を示し、CD21を発現していなかった。そこで、AGS細胞のmRNAからcDNAを作製し、マウスレトロウイルス由来のpLIBベクターにクローニングして、発現cDNAライブラリーを作製した。cDNAクローンを導入発現させる標的細胞として、元来はEBV感染に抵抗性であるが、CD21を発現させることで、EBV感染に高度に感受性となる細胞を探索した。CD21分子を各種動物由来の細胞に導入する実験を行ない、イヌのMDCK細胞がCD21導入によりEBV感受性になり、感染効率も優れていたため、MDCK細胞にcDNAクローンを導入発現させることでExpression cloningを開始した。作製した10^7クローンサイズのcDNAライブラリーを10^4クローンのプールに分けてレトロウイルスを作製し、pLIB1〜100とナンバリングした。それぞれのプールのレトロウイルスをMDCK細胞に感染させ、さらにネオマイシン抵抗性遺伝子とGFP遺伝子を組み込んだ組換えEBVを感染させた後、G418による選択を行った。また、CD21を組み込んだpLIBも作製し、陽性コントロールとした。ネオマイシン耐性のMDCK細胞のコロニー数は、CD21導入細胞では200〜800個で、cDNAライブラリーを導入した場合は0〜8個のMDCK細胞コロニーが出現した。また、遺伝子を導入していない陰性コントロールからも1〜3個のMDCK細胞コロニーが出現、バックグラウンドが認められた。そこで、この段階で耐性MDCK細胞からcDNAを回収することは行わずに、ネオマイシン耐性MDCK細胞のコロニーをたくさん作る4番目の遺伝子プールをさらに解析することにした。4番目の10^4サイズのcDNAプールで形質転換した大腸菌ストックを90分だけ培養し、希釈して、アンピシリンを含むLB培地プレートで1,000個の大腸菌コロニーを形成させ、1,000クローンサイズのcDNAライブラリーのサブプールを10個作製した。このサブプール由来のレトロウイルスをpLIB4-1〜10として、同様な実験を行った。もし、このサブプールのひとつに、EBウイルス高感受性を与えるものがあれば、目的の遺伝子をクローニングするための遺伝子ライブラリーの数を10,000から1,000に減少させることができると考えた。実験の結果、pLIB4-1では耐性MDCK細胞のコロニー数が増加しており、しかもコロニーが近接して観察されたことより、pLIB4-1のプールに目的遺伝子が含まれると考えられた。今後、pLIB4-1を用いて分離した耐性MDCK細胞クローンについて解析を進めていく。

CD21 expression was investigated in 20 cell types, EBV susceptibility and high sensitivity RT-PCR. As a result, AGS cells derived from gastric epithelium showed high EBV infection rate and CD21 expression. The mRNA and cDNA of AGS cells are produced by pLIB and cDNA is produced. The expression of CD21 in target cells was investigated. CD21 molecule introduced into various animal-derived cells. CD21 gene introduced into MDCK cells. CD21 gene introduced into MDCK cells. The cDNA library of the library is controlled by pLIB1 ~ 100 and the library is controlled by pLIB1 ~ 100 For example, if the virus is detected in MDCK cells, the virus will be detected in GFP cells. The CD21 is the first to be tested. The number of CD21-resistant MDCK cells was 200 ~ 800, and the number of CD21-resistant MDCK cells was 0 ~ 8. 1 - 3 MDCK cells were introduced into the cell culture medium, and the cell culture medium was identified. The gene expression of MDCK cells in different stages was analyzed. The cDNA library of 104 species of E. coli was cultured for 90 minutes, and the cDNA library of 1,000 species of E. coli was cultured for 10 minutes. The origin of this article is pLIB4-1 ~ 10. For example, the number of visitors to the website decreased from 10,000 to 1,000, and the number of visitors to the website decreased from 10,000 to 1,000. As a result, pLIB4-1 showed an increase in the number of MDCK cells that were resistant to pLIB4-1. In the future, pLIB4-1 will be used to isolate and analyze MDCK cells.

项目成果

Aozasa, K.: "EBV and malignant lymphoma with special emphasis on pyothorax-associated lymphoma"Current Topics in Microbiology and Immunology. 258. 103-120 (2001)

Aozasa, K.：“EBV 和恶性淋巴瘤，特别强调脓胸相关淋巴瘤”微生物学和免疫学当前主题。

Igarashi M: "Ammonia as an accelerator of tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis of gastric epithelial cells in Helicobacter pylori infection"Infection and Immunity. 69(2). 816-821 (2001)

Igarashi M：“氨作为幽门螺杆菌感染中肿瘤坏死因子α诱导的胃上皮细胞凋亡的加速剂”感染与免疫。