EBウイルスの上皮細胞トロピズムを決定する新規レセプター遺伝子のクローニング

决定 EBV 上皮细胞趋向性的新型受体基因的克隆

基本信息

批准号：
13226001
负责人：
吉山裕規
金额：
--
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13226001/
关键词：
EBウイルス上皮細胞トロピズムレセプタークローニング

项目摘要

20種類の細胞で、EBV感受性と高感度RT-PCRによるCD21発現を調査した。その結果、ヒト胃上皮由来のAGS細胞がもっとも高いEBV感染効率を示し、CD21を発現していなかった。そこで、AGS細胞のmRNAからcDNAを作製し、マウスレトロウイルス由来のpLIBベクターにクローニングして、発現cDNAライブラリーを作製した。cDNAクローンを導入発現させる標的細胞として、元来はEBV感染に抵抗性であるが、CD21を発現させることで、EBV感染に高度に感受性となる細胞を探索した。CD21分子を各種動物由来の細胞に導入する実験を行ない、イヌのMDCK細胞がCD21導入によりEBV感受性になり、感染効率も優れていたため、MDCK細胞にcDNAクローンを導入発現させることでExpression cloningを開始した。作製した10^7クローンサイズのcDNAライブラリーを10^4クローンのプールに分けてレトロウイルスを作製し、pLIB1〜100とナンバリングした。それぞれのプールのレトロウイルスをMDCK細胞に感染させ、さらにネオマイシン抵抗性遺伝子とGFP遺伝子を組み込んだ組換えEBVを感染させた後、G418による選択を行った。また、CD21を組み込んだpLIBも作製し、陽性コントロールとした。ネオマイシン耐性のMDCK細胞のコロニー数は、CD21導入細胞では200〜800個で、cDNAライブラリーを導入した場合は0〜8個のMDCK細胞コロニーが出現した。また、遺伝子を導入していない陰性コントロールからも1〜3個のMDCK細胞コロニーが出現、バックグラウンドが認められた。そこで、この段階で耐性MDCK細胞からcDNAを回収することは行わずに、ネオマイシン耐性MDCK細胞のコロニーをたくさん作る4番目の遺伝子プールをさらに解析することにした。4番目の10^4サイズのcDNAプールで形質転換した大腸菌ストックを90分だけ培養し、希釈して、アンピシリンを含むLB培地プレートで1,000個の大腸菌コロニーを形成させ、1,000クローンサイズのcDNAライブラリーのサブプールを10個作製した。このサブプール由来のレトロウイルスをpLIB4-1〜10として、同様な実験を行った。もし、このサブプールのひとつに、EBウイルス高感受性を与えるものがあれば、目的の遺伝子をクローニングするための遺伝子ライブラリーの数を10,000から1,000に減少させることができると考えた。実験の結果、pLIB4-1では耐性MDCK細胞のコロニー数が増加しており、しかもコロニーが近接して観察されたことより、pLIB4-1のプールに目的遺伝子が含まれると考えられた。今後、pLIB4-1を用いて分離した耐性MDCK細胞クローンについて解析を進めていく。

在20个细胞中研究了高度敏感的RT-PCR的EBV敏感性和CD21表达。结果，源自人胃上皮的AGS细胞显示出最高的EBV感染效率，未表达CD21。因此，从AGS细胞的mRNA中制备cDNA，并将其克隆到源自小鼠逆转录病毒的PLIB载体中，以产生表达的cDNA文库。作为转导和表达cDNA克隆的靶细胞，最初对EBV感染具有抗性的细胞，但通过表达CD21，我们搜索了高度易受EBV感染的细胞。我们进行了实验，其中将CD21分子引入了来自各种动物的细胞中，并且由于CD21引入使Dog MDCK细胞对EBV更敏感，并且感染效率非常好，因此我们开始通过将CDNA克隆引入和表达CDNA克隆来表达克隆。将10^7个克隆大小的准备好的cDNA文库分为10^4个克隆的池，以生成逆转录病毒和编号的PLIB1-100。将MDCK细胞感染每个池的逆转录病毒，然后重组EBV，掺入新霉素抗性基因和GFP基因，然后由G418选择。此外，还准备结合CD21的PLIB以形成阳性对照。对于CD21转导的细胞，新霉素耐药的MDCK细胞的菌落数量为200-800，当引入cDNA文库时，出现0-8 MDCK细胞菌落。此外，1-3 MDCK细胞菌落出现在尚未转染的阴性对照中，并观察到背景。因此，我们决定进一步分析第四个基因库，该基因在此阶段产生了许多耐新霉素的MDCK细胞的菌落，而无需从耐药的MDCK细胞中回收cDNA。用第四个10^4尺寸的cDNA池转化的大肠杆菌库存90分钟，并在含有氨苄青霉素的LB培养基板上稀释，形成1,000个大肠杆菌菌落，创建10个具有1,000克隆大小的cDNA库的子池。使用该子池衍生的逆转录病毒作为PLIB4-1-10进行了类似的实验。如果这些子池中的一个是对EB病毒的高灵敏度，我们认为克隆感兴趣基因的基因库数量可以从10,000降低到1,000。实验结果表明，PLIB4-1中抗性MDCK细胞的菌落数量增加，并且由于近距离观察到菌落，因此人们认为靶基因包含在PLIB4-1的库中。将来，我们将继续分析使用PLIB4-1分离的抗性MDCK细胞克隆。