角膜透明性に関するクロライドチャネルの役割の研究

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研究の成果としては、まず世界ではじめてCLCA2の抗体作成に成功した。またこの抗体の特異性、反応性についてもCLCA2遺伝子をHela細胞に遺伝子導入しこれに対して免疫染色を行い、タグエピトープとの共発現を見ることで証明した。得られた抗体を角膜、結膜、その他の上皮系組織について免疫染色してその発現、局在を調べ、結果としてCLCA2遺伝子はケラチノサイト系上皮細胞の特に基底細胞の基底サイドの細胞膜に極めて特異的に発現していることが判明した。このことは世界に先駆けてわれわれが発見したものである。このことはさらにRT-PCRおよび定量RT-PCRによって確認できた。さらなる微小局在について免疫電顕でしらべたところ、CLCA2はヘミデスモゾームに近接して発現していた。またヘミデスモゾーム構成タンパクであるインテグリンβ4、ラミニン5、コラーゲン7との関連を免疫染色、免疫電顕で調べたところ、両者の間には際立った一致が見られ、機能的な関連が示唆された。さらにCLCA2が単一膜タンパクでなく、他のタンパクと複合体を形成しているかを調べるために、界面活性剤であるTritonX100処理後のCLCA2の染色性を免疫染色で調べた。コントロールのInsulin receptorは単独で存在する膜レセプターであるが、これはTritonX100処理によって染色されなくなった。しかしCLCA2はTritonX100処理後にも染色がほとんど変化せず、他のタンパクおそらくヘミデスモゾーム関連タンパクを介して細胞骨格と複合体を形成しTritonX100にて抽出されない状態にあるものと推定された。今後は角膜上皮細胞のセルライン(hTERTで不死化したもの)にCLCA2遺伝子のsiRNA発現ベクターを導入し、stable cellを得てこれの表現系解析を行うつもりである。