角膜透明性に関するクロライドチャネルの役割の研究

研究氯离子通道对角膜透明度的作用

• 批准号: 02F00813
• 负责人: 木下 茂
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00813/
• 关键词: CLCA2; インテグリンβ4; ラミニン5; TritonX-100; ケラケノサイト; クロライドチャネル; 角膜; 細胞増殖

研究の成果としては、まず世界ではじめてCLCA2の抗体作成に成功した。またこの抗体の特異性、反応性についてもCLCA2遺伝子をHela細胞に遺伝子導入しこれに対して免疫染色を行い、タグエピトープとの共発現を見ることで証明した。得られた抗体を角膜、結膜、その他の上皮系組織について免疫染色してその発現、局在を調べ、結果としてCLCA2遺伝子はケラチノサイト系上皮細胞の特に基底細胞の基底サイドの細胞膜に極めて特異的に発現していることが判明した。このことは世界に先駆けてわれわれが発見したものである。このことはさらにRT-PCRおよび定量RT-PCRによって確認できた。さらなる微小局在について免疫電顕でしらべたところ、CLCA2はヘミデスモゾームに近接して発現していた。またヘミデスモゾーム構成タンパクであるインテグリンβ4、ラミニン5、コラーゲン7との関連を免疫染色、免疫電顕で調べたところ、両者の間には際立った一致が見られ、機能的な関連が示唆された。さらにCLCA2が単一膜タンパクでなく、他のタンパクと複合体を形成しているかを調べるために、界面活性剤であるTritonX100処理後のCLCA2の染色性を免疫染色で調べた。コントロールのInsulin receptorは単独で存在する膜レセプターであるが、これはTritonX100処理によって染色されなくなった。しかしCLCA2はTritonX100処理後にも染色がほとんど変化せず、他のタンパクおそらくヘミデスモゾーム関連タンパクを介して細胞骨格と複合体を形成しTritonX100にて抽出されない状態にあるものと推定された。今後は角膜上皮細胞のセルライン(hTERTで不死化したもの)にCLCA2遺伝子のsiRNA発現ベクターを導入し、stable cellを得てこれの表現系解析を行うつもりである。

The results of the study were successful in the production of CLCA2 antibodies. The specificity and reactivity of these antibodies were demonstrated by the introduction of CLCA2 gene into Hela cells, and the co-expression of CLCA2 gene in Hela cells. The antibody was detected in cornea, conjunctiva, and other epithelial tissues by immunostaining. The results showed that CLCA2 antibody was detected in corneal epithelial cells, basal cells, and cell membranes. This is the first time in the world that we have seen each other. This is the first time that RT-PCR has been used for quantitative RT-PCR validation. In addition, CLCA2 is closely related to the immune system. The relationship between the protein and the immune system is consistent with the relationship between the protein and the function. CLCA2 is a single membrane, its complex is formed, and its staining is modulated by TritonX100. The Insulin receptor is present only in the membrane, and the TritonX100 receptor is present only in the membrane. CLCA2 was treated with Triton X 100, and then stained with Triton X 100. The results showed that CLCA 2 could be used to predict the formation of osteoclast complex. In the future, we will continue to analyze the expression system of CLCA2 gene siRNA in corneal epithelial cells (hTERT).