植物病原糸状菌の感染初期における分子応答機構の解析

植物病原糸状菌の感染初期における分子応答機構の解明には、より多くの病原性変異株の獲得と解析が望ましい。これまでに、アグロバクテリウム形質転換(AtMT)法を用いてアブラナ科炭そ病菌形質転換体を迅速に取得できることを確認している。本年度はAtMT法によって作出した病原性変異株について遺伝子解析を進めるとともに、本法を利用した機能的遺伝子コンプリメンテーション、ターゲティング実験系の確立を試みた。1.AtMT法により作出したアブラナ科野菜類炭そ病菌病原性変異株の遺伝子解析AtMT法により作出した約1000株の形質転換体について宿主葉への接種試験を行い、8株の病原性変異株を得た。これらについてTAIL-PCRを行い、T-DNA挿入部位隣接配列のレスキューを行った。得られたレスキュー断片のシーケンス情報についてBLAST検索を行ったところ、3株について他菌既知遺伝子との相同性が認められた。2.アブラナ科野菜類炭そ病菌病原性関連候補遺伝子の単離類縁菌であるウリ類炭そ病菌において、MAPキナーゼ関連転写因子CST1が病原性に関与することを明らかにしている。保存配列をもとに設計したプライマーを用いてPCRを行うことにより、アブラナ科野菜類炭そ病菌においてCST1と相同性を持つ遺伝子を単離した。3.AtMT法を利用した機能的遺伝子コンプリメンテーション、ターゲティング実験系の確立T-DNA内部にCos部位を含むコスミドベクターを作成し、ゲノミックコスミドライブラリーを構築した。本ベクターを用いることにより、目的コスミドを単離後、AtMT法によりダイレクトに遺伝子コンプリメンテーション、ターゲティング実験が行えると考えた。実際に上述の病原性関連候補遺伝子を含むコスミドクローンを単離し、糸状菌形質転換を行うことによって、本実験系が有効に機能することを確認した。

植物病原糸状菌の感染初期における分子応答機構の解明には、より多くの病原性変異株の獲得と解析が望ましい。これまでに、アグロバクテリウム形質転換(AtMT)法を用いてアブラナ科炭そ病菌形質転換体を迅速に取得できることを確認している。本年度はAtMT法によって作出した病原性変異株について遺伝子解析を進めるとともに、本法を利用した機能的遺伝子コンプリメンテーション、ターゲティング実験系の確立を試みた。1.AtMT法により作出したアブラナ科野菜類炭そ病菌病原性変異株の遺伝子解析AtMT法により作出した約1000株の形質転換体について宿主葉への接種試験を行い、8株の病原性変異株を得た。これらについてTAIL-PCRを行い、T-DNA挿入部位隣接配列のレスキューを行った。得られたレスキュー断片のシーケンス情報についてBLAST検索を行ったところ、3株について他菌既知遺伝子との相同性が認められた。2.アブラナ科野菜類炭そ病菌病原性関連候補遺伝子の単離類縁菌であるウリ類炭そ病菌において、MAPキナーゼ関連転写因子CST1が病原性に関与することを明らかにしている。保存配列をもとに設計したプライマーを用いてPCRを行うことにより、アブラナ科野菜類炭そ病菌においてCST1と相同性を持つ遺伝子を単離した。3.AtMT法を利用した機能的遺伝子コンプリメンテーション、ターゲティング実験系の確立T-DNA内部にCos部位を含むコスミドベクターを作成し、ゲノミックコスミドライブラリーを構築した。本ベクターを用いることにより、目的コスミドを単離後、AtMT法によりダイレクトに遺伝子コンプリメンテーション、ターゲティング実験が行えると考えた。実際に上述の病原性関連候補遺伝子を含むコスミドクローンを単離し、糸状菌形質転換を行うことによって、本実験系が有効に機能することを確認した。