コムギ動原体領域の機能解析

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FISH法を用いて単離したコムギ動原体領域にはレトロトランスポゾンに関連した反復配列が存在している。本研究では、植物染色体における動原体の機能を明らかにするために、コムギ動原体領域を含むバイナリーコスミドクローンCENT14をイネ及びタバコに導入することを試みた。イネは昨年度作出した形質転換体について、PCRなどにより導入遺伝子の有無を調べたが、結果はネガティブであり、全てエスケープであることが分かった。従って、選抜用抗生物質のジェネティシンの濃度を再度検討しながら今春形質転換を行った。その結果、選抜培地上で増殖するカルスを1クローンのみ得た。この1クローンは、再分化培地に移したが、増殖するのみで再分化しなかった。このクローンのカルスから簡易的にDNAを単離しPCRを行ったところ、選抜マーカーのNPTII遺伝子やコムギ動原体関連配列の存在が確認された。つまり、このクローンには確かにCENT14が導入されているが、細胞分裂に少し異常があったために再分化できないものと考えられた。現在このクローンの染色体像をとらえるために、カルスを前処理して押しつぶし標本の作製を行っているところである。タバコについては、導入時にアセトシリンゴンを加えてみることを試みたが、濃度が高くなりすぎると形質転換効率が落ちたことから、高濃度のアセトシリンゴン添加は悪影響であると思われた。様々な条件で作出した形質転換タバコについて、サザンブロット分析を行い、推定コピー数が多いものをピックアップし、成葉から核溶液を調整した。それらを材料にDNAファイバーFISHを2色で行うことを試みた。コンストラクト全体とベクター部分の色分けすることにより、2つのコンストラクトが同じ方向にタンデムに並んでいるシグナルが確認できた。