DNA損傷チェックポイントコントロールの分子機構

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TEL1を制御する因子を同定するために、Tel1と結合するするタンパク質をTwo-hybrid法で同定することを試みた。スクリーニングの結果、2つのpositive clonesが得られたが、両方のcloneとも、Xrs2のC-末端部位をコードしていた。Xrs2は、Mre11とRad50と結合し、複合体を形成し.DSBの修復に関与している。高等動物では、Xrs2ホモログは、Nbs1と命名され、同様にMre11とRad50と複合体を形成し機能している。DSB部位におけるDNA末端は、5'-3' exonuclease活性により分解され、3' tail endをもつ一本鎖DNA(single-stranded DNA;ssDNA)を生じる。このssDNAの形成に、Mre11-Rad50-Xrs2/Nbs1複合体は必須である。Xrs2のC-末端の機能を解析するため、Xrs2のC-末端の欠失変異、xrs2-11変異、を作成した。このxrs2-11変異は、tel1破壊株と全く同じ表現型をしました。また、免疫沈降法により、Xrs2とTel1は結合することが見いだされたが、その結合は、xrs2-11変異の導入により見られなくなった。ATRおよびMec1は、DNA損傷部位に結合することが、報告されている。次にATMホモログであるTel1が、DSBに結合する検討した。Mre11-Rad50-Xrs2複合体の活性を制御するSAE2遺伝子の変異により、TEL1に依存するチェックポイントの活性は上昇する。まず、sae2破壊株を使ってTel1のDSBに結合を、調べることにした。Tel1は、sae2破壊株でDSBに結合することが示されたが、その結合はSae2が存在する細胞内での結合とかわらなかった。つぎに、Tel1の結合が、Xrs2により制御されているか検討した。Tel1の結合は、xrs2破壊細胞およびxrs2-11変異細胞では認められなかった。Xrs2は、DSB部位でのssDNAの形成に必要である。xrs2-11変異細胞でのssDNAの蓄積を検討したが、野生型細胞のssDNAの形成と差がなかった。以上の結果から、Tel1は、Xrs2のC-末端に依存した機能により、DSBに結合することが明らかになった。