食道癌におけるWntシグナル伝達系の遺伝子変異の検索:TCFの活性に注目して

本研究は、食道癌においても大腸癌などと同様に、Wntシグナル伝達系、特にTCF4の活性に注目して研究を進めてきた。平成14年度までに、食道癌細胞株のベータカテニンとサイクリンD1の免疫染色、またTCF4の活性を測定し、食道癌細胞株のTCF活性は大腸癌と同程度であることを示した。また、全ての食道癌細胞株において、ベータカテニンは核に染色されなかった。さらにTCFの免疫染色にて核に強染色され、Wntシグナル伝達系の下流遺伝子であるサイクリンD1もほとんどの細胞株で染色されることが示された。平成15年度は、まず大腸癌と同様にTCF4の活性を下げることによって、食道癌も細胞死を誘導できるかどうかを検討するために、アンチセンスオリゴとRNAiを用いてTCF4の発現を下げることをおこなった。アンチセンスオリゴの実験ではfATGを含む前後の領域で3種類ほど設計を行い、食道癌細胞株TEシリーズと大腸癌細胞株LoVoに導入したが、導入効率が悪いためか期待したような細胞死は誘導できなかった。そこで、次にTCF4の発現をおさえる部位に、RNAiを設計作製し、細胞に導入、RNAを回収し、cDNAを作製、RT-PCRによって、TCF4の発現が低下していることを確認した。しかし、RNAiによってTCF4の発現をおさえても、食道癌細胞株の細胞死は誘導できなかった。免疫染色の結果から、TCF4は恒常的に活性化されており、分解も進んでいないことからTCF4自身に変異がある可能性が示唆されたため、TEシリーズすべてにおいて、TCF4のcoding領域のかかるPCRプライマーを設計し、cDNAを鋳型にPCRを行い、そのproductをTAクローニングしてシークエンスをおこなった。その結果、現在までにTCF4自身に遺伝子変異は指摘し得ていないが、少なくとも4つのsplicing variantがあると思われる。そしてこのvariantが、各々どういった役割を果たしているかとても興味深く、意義あるものと確信している。現在、このvariantについての機能解析研究を進行中である。

本研究は、食道癌においても大腸癌などと同様に、Wntシグナル伝達系、特にTCF4の活性に注目して研究を進めてきた。平成14年度までに、食道癌細胞株のベータカテニンとサイクリンD1の免疫染色、またTCF4の活性を測定し、食道癌細胞株のTCF活性は大腸癌と同程度であることを示した。また、全ての食道癌細胞株において、ベータカテニンは核に染色されなかった。さらにTCFの免疫染色にて核に強染色され、Wntシグナル伝達系の下流遺伝子であるサイクリンD1もほとんどの細胞株で染色されることが示された。平成15年度は、まず大腸癌と同様にTCF4の活性を下げることによって、食道癌も細胞死を誘導できるかどうかを検討するために、アンチセンスオリゴとRNAiを用いてTCF4の発現を下げることをおこなった。アンチセンスオリゴの実験ではfATGを含む前後の領域で3種類ほど設計を行い、食道癌細胞株TEシリーズと大腸癌細胞株LoVoに導入したが、導入効率が悪いためか期待したような細胞死は誘導できなかった。そこで、次にTCF4の発現をおさえる部位に、RNAiを設計作製し、細胞に導入、RNAを回収し、cDNAを作製、RT-PCRによって、TCF4の発現が低下していることを確認した。しかし、RNAiによってTCF4の発現をおさえても、食道癌細胞株の細胞死は誘導できなかった。免疫染色の結果から、TCF4は恒常的に活性化されており、分解も進んでいないことからTCF4自身に変異がある可能性が示唆されたため、TEシリーズすべてにおいて、TCF4のcoding領域のかかるPCRプライマーを設計し、cDNAを鋳型にPCRを行い、そのproductをTAクローニングしてシークエンスをおこなった。その結果、現在までにTCF4自身に遺伝子変異は指摘し得ていないが、少なくとも4つのsplicing variantがあると思われる。そしてこのvariantが、各々どういった役割を果たしているかとても興味深く、意義あるものと確信している。現在、このvariantについての機能解析研究を進行中である。