食道癌におけるWntシグナル伝達系の遺伝子変異の検索:TCFの活性に注目して

寻找食管癌Wnt信号系统基因突变：关注TCF活性

• 批准号: 14770649
• 负责人: 木村 昌弘
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770649/
• 关键词: TCF4; 食道癌; WNTシグナル伝達系; ベータカテニン; LEF1

本研究は、食道癌においても大腸癌などと同様に、Wntシグナル伝達系、特にTCF4の活性に注目して研究を進めてきた。平成14年度までに、食道癌細胞株のベータカテニンとサイクリンD1の免疫染色、またTCF4の活性を測定し、食道癌細胞株のTCF活性は大腸癌と同程度であることを示した。また、全ての食道癌細胞株において、ベータカテニンは核に染色されなかった。さらにTCFの免疫染色にて核に強染色され、Wntシグナル伝達系の下流遺伝子であるサイクリンD1もほとんどの細胞株で染色されることが示された。平成15年度は、まず大腸癌と同様にTCF4の活性を下げることによって、食道癌も細胞死を誘導できるかどうかを検討するために、アンチセンスオリゴとRNAiを用いてTCF4の発現を下げることをおこなった。アンチセンスオリゴの実験ではfATGを含む前後の領域で3種類ほど設計を行い、食道癌細胞株TEシリーズと大腸癌細胞株LoVoに導入したが、導入効率が悪いためか期待したような細胞死は誘導できなかった。そこで、次にTCF4の発現をおさえる部位に、RNAiを設計作製し、細胞に導入、RNAを回収し、cDNAを作製、RT-PCRによって、TCF4の発現が低下していることを確認した。しかし、RNAiによってTCF4の発現をおさえても、食道癌細胞株の細胞死は誘導できなかった。免疫染色の結果から、TCF4は恒常的に活性化されており、分解も進んでいないことからTCF4自身に変異がある可能性が示唆されたため、TEシリーズすべてにおいて、TCF4のcoding領域のかかるPCRプライマーを設計し、cDNAを鋳型にPCRを行い、そのproductをTAクローニングしてシークエンスをおこなった。その結果、現在までにTCF4自身に遺伝子変異は指摘し得ていないが、少なくとも4つのsplicing variantがあると思われる。そしてこのvariantが、各々どういった役割を果たしているかとても興味深く、意義あるものと確信している。現在、このvariantについての機能解析研究を進行中である。

This study は, esophageal に お い て も colorectal cancer な ど と with others に, Wnt シ グ ナ ル 伝 da system, special に TCF4 の active に attention し を て research into め て き た. Pp.47-53 14 year ま で に, esophageal cancer cell lines の ベ ー タ カ テ ニ ン と サ イ ク リ ン D1 の immune dyeing, ま た TCF4 の active を determination し, esophageal cancer cell lines の TCF active は と colorectal cancer with degree で あ る こ と を shown し た. ま た, whole て の esophageal cancer cell lines に お い て, ベ ー タ カ テ ニ ン は nuclear に dyeing さ れ な か っ た. さ ら に TCF の immune dyeing に て nuclear に strong staining さ れ, Wnt シ グ ナ ル 伝 da is の dirty legacy 伝 son で あ る サ イ ク リ ン D1 も ほ と ん ど の cell lines で dyeing さ れ る こ と が shown さ れ た. 15 annual は, pp.47-53 ま ず と colorectal cancer with others に TCF4 の under active を げ る こ と に よ っ て, esophageal も induced cell death を で き る か ど う か を beg す 検 る た め に, ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ と RNAi を with い て TCF4 の 発 now under を げ る こ と を お こ な っ た. ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ の be 験 で は fATG を containing む で の field before and after 3 kinds ほ ど design を い, esophageal cancer cell lines TE シ リ ー ズ と colorectal cancer cell line LoVo に import し た が, import, sharper rate が 悪 い た め か expect し た よ う な induced cell death は で き な か っ た. そ こ で, に TCF4 の 発 now を お さ え る parts に, RNAi を し design system, cell に import, RNA を back 収 し, cDNA を system, rt-pcr に よ っ て, TCF4 の 発 now low が し て い る こ と を confirm し た. The occurrence of をおさえて で, RNAiによってTCF4 によって, esophageal cancer cell line <s:1> cell death をおさえて induction で な な った. Immune dyeing results の か ら, TCF4 は constant に activeness さ れ て お り, decomposition も into ん で い な い こ と か ら に TCF4 itself - different が あ が る possibility in stopping さ れ た た め, TE シ リ ー ズ す べ て に お い て, TCF4 の coding field の か か る PCR プ ラ イ マ ー を design し, cDNA を where に PCR を い, そ の product を TA ク ロ ー ニ ン グ し て シ ー ク エ ン ス を お こ な っ た. そ の result, now ま で に TCF4 itself に heritage 伝 sub - different は blame し have て い な い が, less な く と も 4 つ の splicing variant が あ る と think わ れ る. そ し て こ の variant が, various 々 ど う い っ た "を cut fruit た し て い る か と て も tumblers く, meaning deep あ る も の と sure し て い る. Currently, the functional analysis study of <s:1> <s:1> variantに に て て て て を is underway である.