テロメアDNA四重鎖構造を安定化させテロメラーゼを阻害するポルフィリンの開発

开发稳定端粒 DNA 四链体结构并抑制端粒酶的卟啉

• 批准号: 14771311
• 负责人: 石川 吉伸
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14771311/
• 关键词: ポルフィリン; テロメア; テロメラーゼ; 抗ガン剤; 阻害剤; DNA; 四重鎖; 構造安定化; 阻害

1 テロメア四重鎖DNAとの結合性の解析A 可視吸収の測定 合成したポルフィリンを100mMの塩化カリウムを含んだバッファーに溶解させ、そこにアニーリングして四重鎖構造をとらせた5'-(TTAGGG)_4-3'一本鎖DNAを徐々に加え、可視吸収の変化を測定した。しかしながら平衡が1段階ではなかったため、結合定数をえることができなかった。B 融解温度の測定 四重鎖構造をとらせた5'-(TTAGGG)_4-3'一本鎖DNAにポルフィリンを添加し、昇温しながら260nm又は295nmの吸光度、及びCDを測定した。その融解温度曲線からポルフィリン添加前後での融解温度差(ΔTm)を求めたところ、25℃であった。C 結合様式の解析 四重鎖構造をとらせた5'-(TTAGGG)_4-3'一本鎖DNAにポルフィリンを添加し誘起CDを測定した。その波形からその四重鎖DNAへの結合様式はスタッキングとグルーブ結合であることが示唆された。2 テロメラーゼ活性阻害濃度の算出A テロメラーゼの調製 A549細胞のcell pelletに冷却したCHAPS lysis bufferを加え氷上で30分間インキュベート後、12,000rpm,5℃,20分間遠心し、上清画分をテロメラーゼ酵素源とした。B TRAP法によるテロメラーゼ活性阻害の測定 TRAP_<EZE>テロメラーゼ活性検出キットを用いた。PCRチューブにTRAP buffer、dNTP、TS primer、Taqポリメラーゼ、ポルフィリン及びテロメラーゼを加えPCR反応終了後ゲル電気泳動を行い染色後、テロメアDNAを定量しポルフィリンのテロメラーゼ阻害濃度を求めたところ、申請者が合成した新規ポルフィリンはリード化合物であるTMPyPと比べその阻害濃度が変わらず、TMPyPと同等の阻害活性を示した。

1. Analysis of binding property of quadruple locked DNA by visible absorption assay Synthesis of quadruple locked DNA by 100mM DNA by visible absorption assay Solubility of quadruple locked DNA by visible absorption assayしかしながら平衡が1段阶ではなかったため、结合定数をえることができなかった。B. Determination of melting temperature of quadruple lock structure: 5'-(TTAGGG)_4- 3'-DNA complex: addition, heating, absorbance at 260nm and 295nm, and CD determination. Melting temperature curve before and after the addition of melting temperature difference (ΔTm) Analysis of the four-fold lock structure of C binding protein: 5'-(TTAGGG)_4-3'-DNA binding protein The four-fold lock DNA binding pattern of the wave form is reversed. 2. Calculation of activity inhibition concentration of A549 cell pellet after 30 minutes of cooling, 12,000 rpm,5℃, 20 minutes of centrifugation, supernatant analysis, enzyme source. B TRAP method for determination of activity resistance TRAP_TRAP <EZE>activity PCR TRAP buffer, dNTP, TS primer, Taq buffer, TMPP buffer and TMPP buffer were added after PCR reaction. After electro-kinetic staining, TMPP DNA was quantified and TMPP was synthesized.