2光子励起断層画像法を用いた膵島における開口放出関連蛋白の機能解析

使用双光子激发断层扫描成像对胰岛胞吐作用相关蛋白进行功能分析

基本信息

批准号：
14770019
负责人：
高橋倫子
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

組織深部の観察に適する2光子励起断層画像法と水溶性蛍光色素液を用いて、膵ランゲルハンス島におけるインスリンの開口放出を定量的に検出する手法を確立した。(Takahashi et al. Science297,2002)そこで、本研究課題ではこの手法の同時多重染色性を用いて、開口放出にかかわる蛋白の動態を実際の開口放出現象と関連付けて解析することを目的とした。まず、膜融合に深く関連するSNARE蛋白質のうち、細胞膜に存在するSNAP25の動態を調査した。SNAP25のN末を、GFPの変異体であるECFPで標識し、アデノウィルスベクターでラット膵島に発現させた。水溶性蛍光色素液で膵島を還流しながら、高濃度グルコースで分泌刺激を与え、開口放出がおこった部位における当分子の動態を解析した。その結果、融合細孔を介して顆粒膜に側方拡散する頻度は、単一開口放出現象では5%であるのに対し、逐次開口放出を起こした例では54%に達した。なお、膵島では逐次開口放出が全開口放出現象の2%に著しく抑制されている特徴を我々は発見したが、膜性SNARE蛋白の顆粒膜への拡散障害がその抑制の主因になっているとする仮説を打ち出した。膜内コレステロールの除去により、拡散と逐次開口放出双方の出現頻度が増えることを確認し、両者の間の相関が示唆された。この研究により顆粒膜にSNARE分子が側方拡散を開始するタイミングや、側方拡散したのちに第二の開口放出がおこるまでに潜時などが明らかになった。(論文投稿中)

使用两光子激发断层扫描和水溶性荧光染料溶液确定了一种定量检测胰岛胰岛中胰岛素释放的方法，该溶液适合观察深层组织。（Takahashi et al。Science297，2002）因此，该研究主题旨在分析使用该方法的同时多差异性的实际开放释放现象所涉及的蛋白质。首先，我们研究了与膜融合密切相关的SNARE蛋白中SNAP25的动力学。 SNAP25的N末端用GFP突变体的ECFP标记，并在带有腺病毒载体的大鼠胰岛上表达。将胰岛用水溶性荧光染料溶液回流，并用高浓度的葡萄糖刺激分泌，并在释放开口的位点的该分子的动力学。结果，单开口释放现象的侧向扩散频率为5％，但对于发生颗粒的顺序释放的情况，为54％。此外，我们发现胰岛的顺序释放被总释放总释放的2％显着抑制，但我们提出了这样的假设，即膜snare蛋白扩散到颗粒上是这种抑制作用的主要原因。据证实，去除膜内胆固醇会增加扩散和顺序开放释放的频率，这表明两者之间存在相关性。这项研究揭示了何时开始侧面向颗粒膜扩散的时间，并且在横向扩散后第二次开放之前的潜伏期。（提交纸）