ポリオウィルス感染モデルマウスに導入された遺伝子のモニタリングに関する研究

脊髓灰质炎病毒感染模型小鼠基因监测研究

• 批准号: 14780628
• 负责人: 六車 香里
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Central Institute for Experimental Animals
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780628/
• 关键词: PVRマウス; 導入遺伝子; モニタリング; ポリオウィルス; 安定性

本年度は、導入遺伝子近傍のゲノム領域のクローニングと遺伝子型スクリーニング法の開発を行った。a.導入遺伝子と宿主ゲノムのジャンクション部位のクローニング:ジャンクション部位をカバーした約3kbの断片が得られる制限酵素BglIIによりTgホモ個体ゲノムDNAを消化し、ショ糖密度勾配遠心法によってジャンクション部位を含む断片を回収した。inverted PCR法により塩基配列が未知であるゲノム領域を増幅し、得られたPCR産物のダイレクトシークエンシングにより、導入遺伝子より上流のゲノム領域約1kbをクローニングした。ホモロジー検索の結果、第13染色体B3領域にマップされているBAC Clone No.RP23-62F4(全長約324kb)の一部と配列が一致した。b.PCRによる遺伝子型スクリーニング法の確立:a.の解析結果から、遺伝子が導入された座位の野生型アレルを検出するプライマーセットAを設計し、導入遺伝子を検出するプライマーセットBと共にduplex PCRを行った。PCR産物を視覚化した際に、Tgヘミ個体は野生型アレルと導入遺伝子、Tgホモ個体は導入遺伝子のみのバンドが検出されるようduplex PCRの条件設定を行ったが、Tgホモ個体において野生型アレルの非特異的なバンドが出現したことから、ヘミおよびホモ個体の判別が困難であり、本法による遺伝子型スクリーニングは有効ではないと判断した。そこで、導入遺伝子近傍に残存しているファウンダー系統(ICR)のゲノム領域に着目し、ICRと本マウスのレシピエント系統であるIQIとの間で多型を示し、かつTgと強く連鎖するマイクロサテライトマーカーの検索を行った。その結果、導入遺伝子より約2.0cMの距離に位置するD13Mit10を見出した。本マーカーはホモ個体においてICRタイプのホモ型、ヘミ個体においてICRタイプとIQIタイプのヘテロ型を示すとことから、ヘミおよびホモ個体の判別に有用であると考え、来年度より本マーカーを用いた遺伝子型スクリーニングを実施することとした。

This year は, import, heritage 伝 son nearly alongside の ゲ ノ ム field の ク ロ ー ニ ン グ と heritage 伝 sub-type ス ク リ ー ニ ン グ method の open 発 を line っ た. A. import legacy 伝 son と host ゲ ノ ム の ジ ャ ン ク シ ョ ン parts の ク ロ ー ニ ン グ : ジ ャ ン ク シ ョ ン parts を カ バ ー し た about 3 KB の が fragment must ら れ limitations る enzyme BglII に よ り Tg ホ モ individual ゲ ノ ム DNA digestion and し を シ ョ hook with much sugar density method to に よ っ て ジ ャ ン ク シ ョ を ン parts including む fragment を back 収 し た . Inverted PCR method に よ り salt base with column が unknown で あ る ゲ ノ ム を raised し picture, have ら れ の た PCR products ダ イ レ ク ト シ ー ク エ ン シ ン グ に よ り, import but 伝 よ り upper の ゲ ノ ム area about 1 KB を ク ロ ー ニ ン グ し た. ホ モ ロ ジ ー 検 cable の results, chromosome 13 B3 に マ ッ プ さ れ て い る BAC Clone No. RP23-62 f4 (total length of about 324 KB) の a と match column が consistent し た. P. CR に よ る heritage 伝 sub-type ス ク リ ー ニ ン の グ method established: a. の analytical results か ら, but 伝 が import さ れ た seat の wild-type ア レ ル を 検 out す る プ ラ イ マ ー セ ッ ト a し を design, import, heritage 伝 son を 検 out す る プ ラ イ マ ー セ ッ ト B と altogether に duplex PCR line を っ た. PCR products を apparent 覚 change し た interstate に, Tg ヘ ミ individual は wild-type ア レ ル と import legacy 伝, Tg ホ モ individual は import legacy 伝 son の み の バ ン ド が 検 out さ れ る よ う duplex PCR の conditions set line を っ た が, Tg ホ モ individual に お い て wild-type ア レ ル の of nonspecific な バ ン ド が appear し た こ と か ら, ヘ ミ お よ び ホ モ individual の discriminant が difficult で あ り, this law に よ る heritage 伝 sub-type ス ク リ ー ニ ン グ は have sharper で は な い と judgment し た. そ こ で, import, heritage 伝 son nearly alongside に residual し て い る フ ァ ウ ン ダ ー system (ICR) の ゲ ノ に ム field mesh し, ICR と this マ ウ ス の レ シ ピ エ ン ト system で あ る IQI と の で polymorphism between を し, か つ Tg と strong く chain す る マ イ ク ロ サ テ ラ イ ト マ ー カ ー の 検 cable line を っ た. The result of そ そ, the imported 伝 subsubitor よ 伝 is approximately 2.0cM <e:1> from the に position するD13Mit10を, and the resulting た is seen. This マ ー カ ー は ホ モ individual に お い て ICR タ イ プ の ホ モ type, ヘ ミ individual に お い て ICR タ イ プ と IQI タ イ プ の ヘ テ ロ type を shown す と こ と か ら, ヘ ミ お よ び ホ モ discriminant に useful individual の で あ る と え test, to annual よ り this マ ー カ ー を with い た heritage 伝 sub-type ス ク リ ー ニ ン グ を be applied す る こ と と し た.