紫外共鳴ラマン分光法によるDNA結合蛋白MerRの金属錯体における金属種区別法の解明

使用紫外共振拉曼光谱阐明 DNA 结合蛋白 MerR 金属复合物中金属种类的分化

• 批准号: 03F00100
• 负责人: 北川 禎三
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F00100/
• 关键词: 紫外共鳴ラマン; p53; ガン抑制因子; 共鳴ラマン

本課題の研究対象であるDNA結合蛋白のなかで、まずMerRの単離精製を試みたがうまくいかなかったので、第2候補の亜鉛感受性p53蛋白を取り上げた.p53はガン抑制因子と呼ばれ、DNAの複製や細胞の成長、細胞の分裂などに関わる蛋白質である。ガン細胞にはp53の変異体が多く蓄積することから、この蛋白質が正常に機能していることで腫瘍やガンの成長を抑制していると考えられている。p53に関しては細胞レベルで多くの研究が行われているが、分子レベルでその機能を明らかにした研究は今のところない。そこで本課題ではp53の情報伝達メカニズムを紫外共鳴ラマン分光法を用い、分子レベルで明らかにする。American Type Culture Collectionより入手したヒトのp53のcDNAからDNA結合ドメインをPCRで増幅し、発現ベクターに組み込み、大腸菌での発現系を構築した。DNAから蛋白質への翻訳は3つのヌクレオチドからなるコドンを介して行われるが、真核生物と原核生物では同じアミノ酸でも好んで使用されるコドンが異なるため、真核生物の蛋白質を原核生物である大腸菌で発現させる場合、発現効率が悪いことがある。ヒト由来のp53を用いた本研究でも、発現量が極めて低く、初めは培地1Lあたり0.2mg程度の精製蛋白質しか得られなかった。そこで最適な大腸菌種の選択や発現条件の最適化を行うことで、当初の10倍以上である10mg/培地1L程度の収量が得られるようになった。精製蛋白質は金属を含まないアポ蛋白質だったので、ZnやCu,Niで再構成した。アポ蛋白質の紫外共鳴ラマンスペクトルを測定したところ1478cm^<-1>にトリプトファン由来と思われる強いバンドが観測されたが、Niを再構成した蛋白質では、1398cm^<-1>にシフトしていた。現段階ではまだ詳細を議論できる程の良質なスペクトルが得られていないので、今後は更に蛋白質の精製量を増やし、スペクトルを測定すると共に、変異体を作製し、p53の情報伝達メカニズムを明らかにしていく予定である。

The target of this study is DNA binding protein, MerR protein purification test, and the second candidate lead sensitive p53 protein selection. p53 protein inhibitor, protein related to DNA replication, cell growth, and cell division. P53 protein accumulation in cells is normal, and growth is inhibited. p53 is related to cellular and molecular functions. This topic is about the application of UV resonance spectroscopy in the detection of p53. The American Type Culture Collection started with p53 cDNA and DNA binding genes, and PCR amplification, discovery, and development of E. coli. DNA proteins are expressed in E. coli, E. coli, E In this study, the amount of purified protein was found to be extremely low and low, and the amount of purified protein was 0.2 mg. The optimal conditions for the selection and development of the most suitable E. coli species were obtained by optimizing the amount of E. coli at a level of 10mg/L or more. Refined protein contains metals, Zn, Cu,Ni, and other components. The UV-resonance of protein was detected at 1478 <-1>cm<-1>. At this stage, we will discuss in detail the quality of protein in the process, and in the future, we will increase the amount of protein refined, and determine the amount of protein in the process.