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紫外共鳴ラマン分光法によるDNA結合蛋MerRの金属錯体における金属種区別法の解明

阐明使用紫外共振拉曼光谱区分 DNA 结合蛋白 MerR 金属复合物中金属种类的方法

基本信息

批准号：
03F03100
负责人：
北川禎三
金额：
$ 0.77万
依托单位：
National Institutes of Natural Sciences Okazaki Research Facilities
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F03100/
关键词：
紫外共鳴ラマン p53 ガン抑制因子共鳴ラマン亜鉛感受性蛋白質

项目摘要

DNA結合蛋白MerRを報告されている方法にしたがって単離・精製した。生化学的な活性を測定する量はこれで取れるが、分光学的測定を行うには大量に蛋白を取る必要があり、そのためには発現系を用いてリコンビナント蛋白を作る事が必須であるが、その実験がうまくいかなかった。そこでDNA結合金属蛋白の第2候補である亜鉛感受性p53蛋白を取り上げた。P53はガン抑制因子と呼ばれ、DNAの複製や細胞の成長、細胞の分裂などに関わる蛋白質である。ガン細胞にはp53の変異体が多く蓄積する事から、この蛋白質が正常に機能している事で腫瘍やガンの成長を抑制していると考えられる。本研究ではp53の情報伝達メカニズムを紫外共鳴ラマン分光法を用いて分子レベルで明らかにする事を目的とした。P53のcDNAを入手し、DNA結合ドメインをPCRで増幅して発現ベクターに組込んで大腸菌での発現系を構築した。DNAから蛋白質への翻訳コドンは真核生物と原核生物で好みが違うため、ヒト由来p53を大腸菌で発現させると発現効率が悪かった。初めは1L当り0.2mg程度の蛋白しか得られなかった。そこで発現条件の最適化にかなりの労力を投入し、当初の50倍の収量が得られるようになった。精製物は金属を含まないアポ蛋白質であったので、Zn、Hg、Ni等で蛋白を再構成した。それをヘパリンカラムで精製し、質量スペクトルを測定した。モノマーとオリゴマーの混合物であった。SDS PAGEで分子量を決め、モノマー部分を純粋にして吸収スペクトルを測定した。235と280nmに吸収極大を示した。その244nm励起の共鳴ラマンスペクトルを測定する事に成功した。アポ蛋白質には無くてZn錯体で初めて現れるラマンバンドが911cm^<-1>にあり、これをZnに配位するヒスチヂンの振動に帰属した。またZn錯体には、184、222、260cm^<-1>にラマンバンドが見られた。ラマン励起光の波長を229や206nmにするとそれらのバンドがどう変るかを実験しつつある。

DNA-binding protein MerR is reported to be purified from DNA. Biochemistry activity determination is necessary for the determination of a large number of proteins. DNA-binding metalloproteins are the second candidate for lead-sensitive p53 proteins. P53 is a protein involved in cell growth and cell division. The expression of p53 protein in the cell is normally regulated and its growth is inhibited. The purpose of this study is to investigate the molecular structure of p53 by UV resonance spectroscopy. P53 cDNA was cloned, DNA binding protein was amplified by PCR, and the expression system of E. coli was constructed. DNA protein expression in eukaryotes and prokaryotes is highly dependent on p53 expression in E. coli. 1L of protein at 0.2 mg level. The optimization of the conditions for the development of the project is based on the input of 50 times the original amount. Refined products contain metals, proteins, Zn, Hg, Ni, etc., and proteins are reconstituted. The quality of the product is determined by the quality of the product.モノマーとオリゴマーの混合物であった。SDS PAGE molecular weight determination The absorption maximum at 235 nm and 280nm was observed. The resonance of the excitation at 244nm was successfully measured. The protein has no Zn complex<-1>, and the Zn complex has no vibration. The Zn complex is 184 cm, 222 cm and 260 cm<-1>. The excitation wavelength is 229 nm and 206nm.