紫外共鳴ラマン分光法によるDNA結合蛋MerRの金属錯体における金属種区別法の解明

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DNA結合蛋白MerRを報告されている方法にしたがって単離・精製した。生化学的な活性を測定する量はこれで取れるが、分光学的測定を行うには大量に蛋白を取る必要があり、そのためには発現系を用いてリコンビナント蛋白を作る事が必須であるが、その実験がうまくいかなかった。そこでDNA結合金属蛋白の第2候補である亜鉛感受性p53蛋白を取り上げた。P53はガン抑制因子と呼ばれ、DNAの複製や細胞の成長、細胞の分裂などに関わる蛋白質である。ガン細胞にはp53の変異体が多く蓄積する事から、この蛋白質が正常に機能している事で腫瘍やガンの成長を抑制していると考えられる。本研究ではp53の情報伝達メカニズムを紫外共鳴ラマン分光法を用いて分子レベルで明らかにする事を目的とした。P53のcDNAを入手し、DNA結合ドメインをPCRで増幅して発現ベクターに組込んで大腸菌での発現系を構築した。DNAから蛋白質への翻訳コドンは真核生物と原核生物で好みが違うため、ヒト由来p53を大腸菌で発現させると発現効率が悪かった。初めは1L当り0.2mg程度の蛋白しか得られなかった。そこで発現条件の最適化にかなりの労力を投入し、当初の50倍の収量が得られるようになった。精製物は金属を含まないアポ蛋白質であったので、Zn、Hg、Ni等で蛋白を再構成した。それをヘパリンカラムで精製し、質量スペクトルを測定した。モノマーとオリゴマーの混合物であった。SDS PAGEで分子量を決め、モノマー部分を純粋にして吸収スペクトルを測定した。235と280nmに吸収極大を示した。その244nm励起の共鳴ラマンスペクトルを測定する事に成功した。アポ蛋白質には無くてZn錯体で初めて現れるラマンバンドが911cm^<-1>にあり、これをZnに配位するヒスチヂンの振動に帰属した。またZn錯体には、184、222、260cm^<-1>にラマンバンドが見られた。ラマン励起光の波長を229や206nmにするとそれらのバンドがどう変るかを実験しつつある。