試験管内での視細胞の大量調整および選択的分離法の確立

本年度は、まず、マウス、および、ラットを用いて成体眼球毛様体上皮よりスフェア法を用いて網膜幹細胞を取得する事に成功した。この幹細胞の性状を解析するために、まず、ラット胎生期(胎生14日齢)の前脳由来の神経前駆細胞と成体(6から8週齢)毛様体上皮由来網膜幹細胞の増殖能および分化能を比較検討した。その結果、網膜幹細胞は、胎生期の前能由来の神経幹細胞と比較してその増殖能は悪く、未分化な状態での細胞の維持が困難であるものの、前脳由来の神経幹細胞と異なり、感覚網膜細胞への分化能を有する事を免疫染色およびRT-PCRを用いて明らかとした。また、これらの幹細胞中に発現している遺伝子をRT-PCRで確認したところ網膜の幹細胞は前脳由来の幹細胞と異なり、網膜領域の決定遺伝子であるChx10や、Rxを発現する一方で、Pax2などの前脳得意的な遺伝子は発現していない事が明らかとなり、網膜幹細胞の特異性は、このような内在性の因子によって決定されている可能性が明らかとなった。さらに、より大型棒物であり、移植実験などに使用が容易である家兎を用いて同様の網膜前駆細胞を取得する事に成功した。更に、培地にメチルセルロースを添加する事によって、ほとんど細胞凝集がなく、網膜前駆細胞を単一細胞から培養し、個々の網膜前駆細胞の増殖分化能を検討する系を確立した。その結果、家兎の成体毛様体から取得される網膜前駆細胞は約20%が2分化能以上を有する細胞である程度未分化で増殖能があるもののあるものの、残りの80%はほとんどグリア系の細胞へと分化し、増殖能力も限られた細胞である事が明らかとなった。

本年度は、まず、マウス、および、ラットを用いて成体眼球毛様体上皮よりスフェア法を用いて網膜幹細胞を取得する事に成功した。この幹細胞の性状を解析するために、まず、ラット胎生期(胎生14日齢)の前脳由来の神経前駆細胞と成体(6から8週齢)毛様体上皮由来網膜幹細胞の増殖能および分化能を比較検討した。その結果、網膜幹細胞は、胎生期の前能由来の神経幹細胞と比較してその増殖能は悪く、未分化な状態での細胞の維持が困難であるものの、前脳由来の神経幹細胞と異なり、感覚網膜細胞への分化能を有する事を免疫染色およびRT-PCRを用いて明らかとした。また、これらの幹細胞中に発現している遺伝子をRT-PCRで確認したところ網膜の幹細胞は前脳由来の幹細胞と異なり、網膜領域の決定遺伝子であるChx10や、Rxを発現する一方で、Pax2などの前脳得意的な遺伝子は発現していない事が明らかとなり、網膜幹細胞の特異性は、このような内在性の因子によって決定されている可能性が明らかとなった。さらに、より大型棒物であり、移植実験などに使用が容易である家兎を用いて同様の網膜前駆細胞を取得する事に成功した。更に、培地にメチルセルロースを添加する事によって、ほとんど細胞凝集がなく、網膜前駆細胞を単一細胞から培養し、個々の網膜前駆細胞の増殖分化能を検討する系を確立した。その結果、家兎の成体毛様体から取得される網膜前駆細胞は約20%が2分化能以上を有する細胞である程度未分化で増殖能があるもののあるものの、残りの80%はほとんどグリア系の細胞へと分化し、増殖能力も限られた細胞である事が明らかとなった。