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ニワトリB細胞株を利用する抗体の分子進化システムの構築と応用

鸡B细胞系抗体分子进化体系的构建及应用

基本信息

批准号：
15760589
负责人：
金山直樹
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15760589/
关键词：
分子進化工学タンパク質工学抗体 DT40 遺伝子変換

项目摘要

本研究は、DT40細胞の抗体遺伝子改変能力を利用して、抗体の分子進化システムを構築することを目的としている。昨年度、DT40細胞株において抗体遺伝子への突然変異と遺伝子変換の導入を厳密かつ任意に制御するために、突然変異と遺伝子変換に必須の因子であるAID遺伝子の発現をCre/loxPシステムを用いた遺伝子組み換えによって制御できる細胞株の育種を達成した。この細胞は、導入したCre-ERにより、4-hydroxytamoxyfen(4-OHT)添加時にloxPで挟まれたAIDの発現をON/OFFする。AIDの発現はGFPの発現でモニターし、AID OFFの時はピューロマイシン耐性として選択できる。本年度、この細胞の変異能力とスイッチ能力について評価した。4-OHTで48時間処理後、48時間追加培養したところ、OFF細胞から平均20%のGFP陽性細胞が出現した。このGFP陽性をセルソーターによって一細胞ずつ分離してAID ON細胞として培養した。2ヶ月間の継続培養後、ほぼすべてがGFP陽性であり、AIDの発現が安定して維持されていることが明らかになった。また、抗体軽鎖遺伝子上に蓄積された変異を解析したところ、解析した24クローン中13クローンで変異が認められ、DT40が本来有している能力に相当するあるいはそれ以上の変異能力を有していた。さらに、ON細胞を4-OHT処理したところ、平均50%のGFP陰性細胞が出現し、ピューロマイシン添加によりOFF細胞のみに純化できた。このOFF細胞から、再度の4-OHT処理でON細胞が出現し、ON細胞の単離、培養、OFF細胞へのスイッチが繰り返し可能であった。すなわち、この細胞を用いて、有用な変異体を取得後、AID OFFにより変異を固定し、再度ONにして抗体遺伝子に二次的変異を導入して改良することが可能になった。

In this study, the ability to modify antibody mutants in DT40 cells was used to improve the ability to modify antibodies by using antibodies and antibody molecules. Last year, DT40 cell strain anti-virus antibody positive cells were suddenly linked to the secret control system. All of a sudden, the key factors must be used to control the growth of Cre/loxP cell lines. In order to realize the effect of Cre/loxP virus infection, it is necessary to control the growth of cell lines by using the vaccine subgroup. Check your cell, enter your Cre-ER account, and 4-hydroxytamoxyfen (4-OHT) add time loxP hijack AID to detect ON/OFF failure. The AID system shows that the GFP does not have any symptoms, and the AID OFF does not need to change the endurance test. This year, we will learn more about our abilities and abilities. After 48 hours of treatment in 4-OHT, additional training was performed in 48 hours, and an average of 20% of GFP cells were found in OFF cells. The GFP was separated from the AID ON cell and the cell was cultured. 2. After the monthly training, we will check the GFP sex training and AID to ensure the stability and maintenance of the training program. There are some problems in the analysis of antibodies, antibodies, 4-OHT of ON cells, average 50% of GFP cells were detected, and OFF cells were added. The OFF cell is isolated, the ON cell is isolated, the cell is isolated, and the OFF cell is isolated. After the cells have been obtained, AID OFF cells have been fixed, and ON antibodies have been used for the second time.